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海洋酸化（ocean acidification,OA）对海洋生物,尤其是海洋钙化生物有潜在的负面影响。其直接影响是对生物体内酸碱平衡的干扰,并进一步影响钙化过程、能量代谢和免疫反应等。长牡蛎（Crassostrea gigas）是生活在河口和潮间带区域重要的双壳贝类,具有重要的生态地位和经济价值。本研究综合运用分子生物学、生物信息学、生理学、免疫学及转录组学等相关技术,查明了几种关键酸碱调节蛋白的结构特征及其在长牡蛎对酸化响应过程中的生理调节功能,分析了长牡蛎血淋巴细胞在短期和长期CO2胁迫下的基因表达变化,初步探讨了双壳贝类对海洋酸化的响应和适应机制。本研究从长牡蛎基因组中克隆得到一个细胞内碳酸酐酶（CgCAII-1）。通过生物信息学分析,CgCAII-1在进化中相对保守,含有一个典型的CA结构域,不含跨膜域或信号肽。重组蛋白rCgCAII-1能将CO2转化为H+和HCO3-,受到CA抑制剂acetazolamide（AZ）的抑制。酸化处理后,其在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃、血淋巴细胞中的表达量显著增加,且CgCAII-1蛋白定位在血淋巴细胞膜上,且主要聚集在外套膜上皮细胞、膜泡结构以及鳃丝内部参与化学平衡的维持。酸化处理实验以及酸化和抑制剂共处理实验表明,高浓度CO2使得血淋巴细胞内的pH值（intracullular pH,pHi）显著上升且碳酸酐酶参与调控pHi。酸化处理后,鳃和外套膜中的碳酸酐酶活性下降或保持不变,表明长牡蛎在CO2胁迫下可能通过提高CgCAII-1的表达,减弱其对CO2的转化并加强其与膜蛋白等的作用,从而促进离子运输和酸碱调节。本研究克隆获得长牡蛎分泌型碳酸酐酶（CgCA）的cDNA序列,发现其含有一个信号肽和一个典型的CA结构域。通过对其发育时期和组织表达水平检测,发现其在D-型幼虫时期表达水平最高,且主要分布于外套膜和血淋巴细胞中,表明其可能参与钙化过程。酸化处理后,CgCA在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃和血淋巴细胞中的表达水平显著上调,且其蛋白形式能够在血淋巴细胞的细胞质中和细胞膜上以及外套膜的褶皱结构中发生聚集,说明其可能聚集到长牡蛎的钙化结构中。同时,酸化处理还使得血淋巴细胞内Ca2+浓度显著降低。进一步的抑制处理和CgCA干扰实验发现,CgCA与血淋巴细胞的Ca2+浓度负相关。钙离子试剂Ionomycin处理实验发现,细胞内Ca2+浓度的变化影响CgCA在外套膜组织中的分布。据此,本研究提出CgCA-Ca2+互调机制,酸化处理下这种互调作用可能更为密切且影响长牡蛎钙化平衡的维持和贝壳的分泌。本研究从长牡蛎基因组中鉴定出了游离的腺苷酸环化酶（soluble adenylyl cyclase,sAC）的同源基因CgsAC并克隆表达了其CycC结构域。酶活测定实验发现,重组蛋白MBP-rCgsAC和鳃组织中的天然蛋白均受HCO3-激活,生成cAMP,且受到sAC特异性抑制剂KH7的抑制。酸化处理后,CgsAC在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃和血淋巴细胞中的表达水平显著上调。免疫印迹实验发现其在组织中蛋白发生剪切作用生成45 kD和20 kD的蛋白。同时,血淋巴细胞内部分CgsAC从细胞质中转移到细胞膜上。酸化处理后,鳃和外套膜组织中cAMP含量及血淋巴细胞的pH值显著升高,且这些变化受到KH7的抑制,说明酸化处理激活了HCO3-/CgsAC/cAMP信号通路。酸化处理实验以及酸化和KH7共处理实验表明,高浓度CO2引起的血淋巴细胞的吞噬率的下降、ROS水平的上升、凋亡率的下降、组织和线粒体ATP的变化等过程均受到CgsAC的调节。血淋巴细胞caspase-3和caspase-9活性测定实验发现,caspase-3和caspase-9活性线性相关,而caspase-8活性没有变化。表明酸化能够激活线粒体凋亡途径,且CgsAC参与调控由酸化引起的凋亡。本研究共构建了正常组、短期组（CO2处理7天）、长期组（CO2处理60天）共9个长牡蛎血淋巴细胞转录组文库,共得到72,504,095单端变长的reads,共鉴定出28,027个基因,其中短期组/正常组之间共有501个差异基因,长期组/正常组之间共有2728个差异基因。对差异表达基因中FPKM值倍数变化<0.5或>2的基因进行了GO富集分析,发现在短期组和长期组上调表达基因中,细胞成分类别中注释为‘membrane’及分子功能（MF）类别中注释为‘ion binding’的基因比例较大。分子功能类别中注释为‘heterocyclic compound binding’的基因占有较大比例,大多数基因与ATP、GTP的结合或DNA、RNA的结合相关,与短期组相比,长期组中更多与运输和信号转导的基因和DNA、RNA结合相关的基因上调表达。长期组差异表达基因中,分子功能类别中注释为‘Calcium ion binding’的基因也占有较大比例,且主要为上调表达。此外,细胞内的Ca2+水平短期酸化处理下显著下降,长期酸化处理下恢复到正常水平,而血清中钙含量持续升高,说明长牡蛎可能通过钙结合蛋白将细胞内Ca2+转运到血清中从而实现细胞内Ca2+的充分补偿。血清中的葡萄糖短期酸化处理下显著下降,而长期的酸化处理下显著上升,显著高于对照组。肝糖原的变化趋势与葡萄糖的变化趋势类似。因此,短期的酸化处理会引起膜蛋白和离子结合相关基因、ATP或GTP结合相关的基因（如细胞骨架基因）的差异表达,造成细胞内钙离子水平的上升和血清中葡萄糖含量下降,同时储存的肝糖原加速分解等应激反应。而长牡蛎在长期的酸化处理下,通过激活更多离子和酸碱调节蛋白的转录作用,诱导与复制、转录、翻译等过程相关的基因的表达,上调表达大量钙结合蛋白实现细胞内Ca2+的充分补偿,增加营养物质的吸收和储存等多种调节机制,以适应高浓度CO2环境。综上所述,面对不断上升的CO2浓度和下降的pH,长牡蛎已建立了自身的应对策略。其能迅速的增加CA的表达水平,促进CA的功能转变,加强对酸碱平衡和钙化水平等的调节,激活HCO3-作为信号分子的HCO3-/CgsAC/cAMP调节通路,调节下游免疫反应和能量代谢等过程。另外,长牡蛎作为典型的潮间带生物,其已建立了短期酸化处理下的应激和长期酸化处理下的适应机制。