论文部分内容阅读
桔青霉变异株F-33是由桔青霉4011菌株经过60Co诱变、及原生质融合中获得的一株产红色素菌株。本文主要从变异株的产色性状及生长特征、不同培养条件对产色的影响，以及色素的分离纯化三方面开展了初步研究。
采用PDA、MEA、CYA、YES培养基对4株桔青霉菌株进行形态学研究，并以RAPD-PCR来分析4株菌株的遗传差异性。桔青霉4011菌株经过60Co诱变、及原生质融合后，变异株产色性状存在较大差异。通过比较发现变异株菌落颜色与其核酸酶P1的产量高低具有一定的关联性。高产菌株一般菌落为白色、灰绿等，而黄绿和绿色的菌落其核酸酶P1低产的可能性较大。F-33是一株产水溶性红色素的变异株。桔青霉F-33在PDA培养基和MEA培养基可以产生大量水溶性红色素，而在YES培养基和CYA培养基产红色素较少。在微观结构上，与其他菌株相比桔青霉F-33菌体的帚状分枝细而密集，分生孢子丰富。在RAPD-PCR反应中，从24条随机引物中获得多态性较丰富的6条。再次通过RAPD-PCR进行多态性分析，结果表明F-33与其它菌株存在遗传差异。桔青霉4011和桔青霉F-33亲缘较近，而桔青霉60CO诱变株JIY6和桔青霉原生质融合子F5-5的亲缘较近。
使用色差计测量色度指标，引入CIELAB均匀空间系统，采用Chroma(饱和度，越大越好)和Hue angle(色彩角，越接近O越纯)并结合TLC来分析色素在不同条件下的变化。在PDA中28℃培养48小时、72小时和96小时，色素的色彩角和饱和度分别是(51，39)、(47，26)、(39，19)，比较稳定；25℃下培养，色素色彩角和饱和度分别是(36，27)、(52，29)、(19，72)。但从TLC来看，28℃条件下的色素条带比25℃的清晰，而且25℃培养48小时的条带显示有大量黄色素，培养96小时则色彩角突然增大，发酵液变黄。而33℃培养，几乎都没有红色素产生，37℃培养则菌体不生长，饱和度基本小于20。因此判定菌体在28℃生长最好。
乙酸缓冲液、磷酸缓冲液和柠檬酸缓冲液会抑制红色素的合成分泌。三种缓冲液体系里，色素的饱和度都很小，结合TLC可以发现色素的条带不清晰。
碳源对红色素影响较大，短链碳源对色素合成的抑制作用要大于长链碳源，其中淀粉的效果略好，而葡萄糖的抑制作用最大。TLC条带的清晰度也验证了结果。对比PDA培养基，推测PDA中独有的多酚类物质对红色素的合成有较大促进作用。
氮源对红色素有明显的促进作用，其中以Poly peptone和Tyrptone为氮源的培养基在培养96小时所产色素的饱和度和色彩角达到(59，35)和(60，33)，相比对照组PDA的饱和度和色彩角(39，19)，饱和度明显偏大，但是色彩角也偏大，表明色素略为偏黄。再结合TLC，除了PDA中的色素可以分离出多个条带，其他培养基里的色素都只有一个拖尾很严重的条带，因此本实验的TLC体系已不再适合这些培养基所产红色素的分离，说明这些红色素的结构已经发生了较大的变化。
采用离心、萃取、柱层析和高效液相方法对发酵液中的色素进行了分离纯化研究。发酵液离心取上清后进行萃取，其中乙酸乙酯的萃取作用最好，而在柱层析粗分过程中，丙酮和填料为硅胶Kisselgel G60的洗脱效果较好，配合甲醇洗脱，可以获得2种粗组分，分别是丙酮洗脱液和甲醇洗脱液，旋转蒸干得到粗品I和粗品II。其中粗品I成份较简单，粗品II成分复杂。最后用高效液相对粗品I做了分析和纯化，获得2种纯品，另一种为红色素I-a，最大吸收值为518nm；-种为黄色素I-b，最大吸收值为390nm。