基于反酵母双杂交系统的GPⅡb/Ⅲa拮抗剂筛选模型的构建尝试及GPⅢa亚基N末端转录激活区的初步研究

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GPIIb/IIIa是血小板表面主要的糖蛋白受体之一,在血栓形成中起着重要的作用。血栓是在血管内部或心室中形成的血液凝块。当体内凝血和抗凝血系统紊乱时,可导致血栓形成。血栓形成和很多疾病相关,如冠状动脉病(CAD)、冠心病(CHD)、脑中风(Stroke)、急性心肌梗死(Acute Myocardial:Infarction)、心绞痛(angina),肺栓塞(P’IE)等心血管疾病。据世界卫生组织调查统计,每年全球因为心脑血管疾病死亡的总人数超过1300万人,占死亡总人数的40%左右。血小板聚集是血栓形成的最初过程,而fibrinogen与其受体GPIIb/IIIa的结合是各种激活剂活化血小板后导致血小板聚集的最终步骤,因此GPIIb/IIIa的拮抗剂可以有效地防止和阻断血栓的形成。 传统的GPIIb/IIIa拮抗剂的筛选,一般采用抗血小板聚集的方法,或抗fibrinogen与GPIIb/IIIa结合的方法,需要使用新鲜的血小板或从血液中纯化的fibrinogen和GPIIb/IIIa。我们采用酵母双杂交系统,希望建立一个适合于高通量筛选的GPIIb/IIIa拮抗剂的筛选模型。根据已有的体外实验数据及结构分析,我们将参与结合的,来自GPIIb/IIIa和。fibfinogen的结构域片段,分别融合到Ga14DNA:Binding Domain和Ga14 Acitvation Domain。然后检测这些片段在酵母中是否能相互作用。如果能相互作用,当加入小分子拮抗剂时,就可以通过报告基因的检测到相互作用是否受到了破坏。但是我们尝试了16对片段,它们都不能在酵母中相互作用。 在进行上述实验时,由于PCR反应中使用的Taq酶的低保真性,我们得到了GPIIIa一个突变的cDNA片段,编码了GPIIIa(4-56)这一段基因,并在最后加了一个多余的Q。我们发现当该片段与Ga14 DNA Binding Domain融合时,具有转录激活的活性。进一步的实验我们将这一功能区定位到GPIIIa(23-77)这一区段。而后的实验我们发现当将GPIIIa(4—454)这一片段融合到EGFP的C末端时,融合蛋白能进入核内。
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