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电化学发光（Electrochemiluminescence,ECL）分析技术由于其检测范围宽、灵敏度高、操作方便等优点，已经成为近几年较为热门的生物分析手段之一。本文利用氧化铟锡（ITO）导电玻璃作为生物免疫传感器基底，结合具有较大比表面积、高催化活性和高导电性的多功能金纳米花（Goldnanoflowers,AuNFs），设计了两种新型无酶ECL免疫传感策略，实现了对甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）这两种肿瘤标记物（Tumormarker,TM）的高灵敏度、高选择性检测。
本文的研究工作主要分为以下四个部分：
一、阐述论文的研究背景和意义。首先，介绍肿瘤标记物的概念、特点和研究进展；其次总结了ECL的概念和鲁米诺（Luminol）的发光机理及其特点；然后，论述了功能纳米材料的特点、分类以及在双信号ECL传感器上的应用；最后，介绍该课题的研究意义和研究内容。
二、制备金纳米花/氧化铟锡玻璃（AuNFs/ITO）基础电极，并研究其性能。采用种子生长法，将球形金纳米粒子（Goldnanoparticles,AuNPs）作为种子、四氯金酸和盐酸羟胺的混合溶液作为生长液，制备出形态相似、大小均一的金纳米花。再利用ITO导电玻璃为基底、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）作为粘接剂，将AuNFs组装固定在ITO玻璃表面构成基础电极。最后，使用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、紫外可见分光光度计（UV-vis）、X射线粉末衍射仪（XRD）、循环伏安法（CV）、电化学阻抗法（EIS）和ECL法对AuNFs和基础电极进行表征测试。
三、构建牛血清蛋白/AFP抗体/金纳米花/ITO（BSA/anti-AFP/AuNFs/ITO）免疫传感器，并在鲁米诺-氧气（Luminol-O2）系统中检测AFP的含量。首先，将anti-AFP和BSA固定在生物相容性好的AuNFs/ITO基础电极上形成最终免疫传感器，当传感器上的anti-AFP与待测AFP特异性结合后，再将其浸泡在含有三羟甲基氨基甲烷（Tris）的溶液，利用AuNFs特殊的空间结构，以及Tris上氨基和羟基的给电子作用，使得AuNFs能原位催化溶解的氧气产生过氧化氢（H2O2）。随后，产生的H2O2又可以在电极的正电位进一步生成各种活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROSs），各种ROSs能显著增强信号探针luminol的ECL信号强度和稳定性。由于待测的AFP特异性结合anti-AFP形成的免疫复合物阻碍了传感界面的电子传递，从而导致ECL信号的淬灭。最终，我们测得ECL信号猝灭的程度与AFP浓度的对数有较好的线性关系，其线性范围为0.01-100ngmL-1，检测限为3.4pgmL-1（S/N=3）。此传感器制备方法简单、特异性强、稳定性高且成本低廉，最重要的是此策略无需生物酶和外加共反应剂（如过氧化氢等）的参与，即可原位产生H2O2使信号得到放大，因此简化了检测步骤并提高检测的灵敏度，使AFP的检测更加快捷高效，非常适用于一次性可抛弃式快速检测，在工业生产和临床检测中具有广泛的应用前景。
四、我们还构建了BSA/anti-CEA/AuNFs/ITO双信号免疫传感器，并用于CEA的定量分析。在此体系中，利用AuNFs独特的电催化活性，使AuNFs表面的氧气（O2）在不需要生物酶的参与下，即可在负电位被电催化进行氧还原反应（Oxygenreductionreaction,ORR），使溶解的氧气得到电子并产生过氧氢根离子（HO2-）和各种ROSs。HO2-在阴极可以直接与鲁米诺阴离子反应产生阴极ECL信号，而且各种ROSs能显著增强luminol的阳极ECL信号。我们将较强的阳极ECL信号变化用来对待测CEA进行定量分析，并用阳极/阴极信号强度的比值来判断检测结果的准确性。在最佳优化条件下，该传感器对CEA的检测范围为0.001-100ngmL-1，检测限低至0.32pgmL-1。此外，利用该策略产生的双信号响应，可以消除部分干扰和误差，避免假阳性或假阴性检测结果，使其更好的应用于临床检测分析。
本文的研究工作主要分为以下四个部分：
一、阐述论文的研究背景和意义。首先，介绍肿瘤标记物的概念、特点和研究进展；其次总结了ECL的概念和鲁米诺（Luminol）的发光机理及其特点；然后，论述了功能纳米材料的特点、分类以及在双信号ECL传感器上的应用；最后，介绍该课题的研究意义和研究内容。
二、制备金纳米花/氧化铟锡玻璃（AuNFs/ITO）基础电极，并研究其性能。采用种子生长法，将球形金纳米粒子（Goldnanoparticles,AuNPs）作为种子、四氯金酸和盐酸羟胺的混合溶液作为生长液，制备出形态相似、大小均一的金纳米花。再利用ITO导电玻璃为基底、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）作为粘接剂，将AuNFs组装固定在ITO玻璃表面构成基础电极。最后，使用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、紫外可见分光光度计（UV-vis）、X射线粉末衍射仪（XRD）、循环伏安法（CV）、电化学阻抗法（EIS）和ECL法对AuNFs和基础电极进行表征测试。
三、构建牛血清蛋白/AFP抗体/金纳米花/ITO（BSA/anti-AFP/AuNFs/ITO）免疫传感器，并在鲁米诺-氧气（Luminol-O2）系统中检测AFP的含量。首先，将anti-AFP和BSA固定在生物相容性好的AuNFs/ITO基础电极上形成最终免疫传感器，当传感器上的anti-AFP与待测AFP特异性结合后，再将其浸泡在含有三羟甲基氨基甲烷（Tris）的溶液，利用AuNFs特殊的空间结构，以及Tris上氨基和羟基的给电子作用，使得AuNFs能原位催化溶解的氧气产生过氧化氢（H2O2）。随后，产生的H2O2又可以在电极的正电位进一步生成各种活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROSs），各种ROSs能显著增强信号探针luminol的ECL信号强度和稳定性。由于待测的AFP特异性结合anti-AFP形成的免疫复合物阻碍了传感界面的电子传递，从而导致ECL信号的淬灭。最终，我们测得ECL信号猝灭的程度与AFP浓度的对数有较好的线性关系，其线性范围为0.01-100ngmL-1，检测限为3.4pgmL-1（S/N=3）。此传感器制备方法简单、特异性强、稳定性高且成本低廉，最重要的是此策略无需生物酶和外加共反应剂（如过氧化氢等）的参与，即可原位产生H2O2使信号得到放大，因此简化了检测步骤并提高检测的灵敏度，使AFP的检测更加快捷高效，非常适用于一次性可抛弃式快速检测，在工业生产和临床检测中具有广泛的应用前景。
四、我们还构建了BSA/anti-CEA/AuNFs/ITO双信号免疫传感器，并用于CEA的定量分析。在此体系中，利用AuNFs独特的电催化活性，使AuNFs表面的氧气（O2）在不需要生物酶的参与下，即可在负电位被电催化进行氧还原反应（Oxygenreductionreaction,ORR），使溶解的氧气得到电子并产生过氧氢根离子（HO2-）和各种ROSs。HO2-在阴极可以直接与鲁米诺阴离子反应产生阴极ECL信号，而且各种ROSs能显著增强luminol的阳极ECL信号。我们将较强的阳极ECL信号变化用来对待测CEA进行定量分析，并用阳极/阴极信号强度的比值来判断检测结果的准确性。在最佳优化条件下，该传感器对CEA的检测范围为0.001-100ngmL-1，检测限低至0.32pgmL-1。此外，利用该策略产生的双信号响应，可以消除部分干扰和误差，避免假阳性或假阴性检测结果，使其更好的应用于临床检测分析。