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小分子肽运输蛋白(peptide transporter family,PTR family)是一类依靠质子驱动力(proton-motive force,PMF)作为能量介导底物进行跨膜运输的可饱和性载体,按照底物的不同可分为两大类,第一类是介导二肽或三肽进行跨膜运输的小分子肽运输蛋白(peptide transporters,PTRs),而另一类是介导硝酸根离子进行跨膜运输的低亲和力硝酸根运输蛋白(low-affinity nitrate transporters,NRT1)。目前测试小分子肽运输蛋白底物最为有效的两种方法是酵母突变体功能互补试验和蟾蜍卵母细胞注射的电生理试验。水稻中PTR家族成员数目非常庞大,暗示着他们在水稻的生长和发育过程中可能起非常重要的作用。为了研究OsPTR2基因的功能,我们做了以下几个方面的工作:
1.植物表达载体的构建及其水稻转化。成功构建了OsPTR2启动子与GUS融合表达载体、OsPTR2与GFP融合表达载体、OsPTR2超表达及RNAi载体,并将其转化水稻,获得转基因植株。
2.对OsPTR2可能运输的底物进行了测试。通过酵母突变体功能互补试验,对五种二肽和三肽(Gly-Leu、Gly-His、Gly-Gly-Leu、Gly-His-Gly、Leu-Trp)进行了运输测试,结果发现OsPTR2不具有对这些底物的运输能力。
3.对OsPTR2基因表达模式进行了分析。通过生物信息学、RT-PCR及对转基因Promotor::GUS植株的GUS染色分析,发现OsPTR2基因在水稻的根、茎、叶、穗中均有表达,但在根中的表达量非常低,而其他三种器官都有较高的表达量。GUS染色结果显示,OsPTR2基因在种子萌发时的胚根维管束、胚芽尖端及整个胚芽鞘中表达量较高;在种子发育过程中的枝梗、颖壳等部位表达较强,但在花丝、花药及胚乳中未见表达,说明OsPTR2可能在胚的形成和发育过程中起营养运输的作用。半薄切片显示,GUS的表达主要集中在维管束附近,但是周围的薄壁细胞也有表达,说明OsPTR2不仅参与营养物质的长距离运输,而且参与其短距离运输的过程。
4.对OsPTR2超表达和RNA干涉植株的表型性状进行了初步的分析。对转基因T1代单株的种子总数、饱满数、空壳数、结实率、穗长、一次枝梗个数等进行了统计。结果表明,超表达植株的穗长与对照中花11相比没有明显差异,种子总数稍低,个别株系的结实率显著性下降;RNA干涉植株的穗长变短,分枝数目减少,种子总数降低,但是结实率反而还有所增加。
5.T-DNA插入突变系的鉴定和分析。用PCR的方法鉴定了两个独立的T-DNA插入突变系,分别命名为ptr2-1和ptr2-2。ptr2-1的T-DNA是插入在OsPTR2基因的第二个外显子区域,ptr2-2的T-DNA插入位点是OsPTR2基因的3’端非翻译区(3’-UTR)。PCR结果表明,ptr2-1 T3代的11个单株全部为纯合插入体,Southern杂交结果表明ptr2-1是一个单拷贝插入突变体;而ptr2-2 T3代的单株中只有杂合插入体和分离出来的野生型,而没有纯合的插入体。突变体发芽率降低,生长延缓;植株变矮,分蘖能力增强,结实率下降,种子灌浆受阻;花粉活力降低,数目减少,形态异常:各器官内组织结构发生变异。
综上所述,我们可以做出以下推论:OsPTR2基因编码的蛋白质是一种跨膜的运输载体,它在水稻体内运输的底物可能是一种有机化合物。这种有机化合物在水稻的生长和发育过程中起着非常重要的作用,它的缺失造成了植株的微管、花丝、花药等组织和器官发育的不正常,最终导致水稻穗长变短,结实率降低等表型的发生。