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交替氧化酶(Alterative oxidase, AOX)是广泛存在于植物、藻类、真菌和原生生物线粒体内膜的交替呼吸途径终端氧化酶,从主呼吸链的辅酶Q分岔,氧化辅酶Q、还原氧分子生成水。交替氧化酶氧化过程没有质子穿膜运动、不产生膜电子势差,没有ATP产生,能量以放热方式散发。交替氧化酶是双铁羧酸蛋白质家族的膜蛋白质,至今只有其二级结构的几种假设模式,最新的模式认为交替氧化酶是膜界面蛋白质,不是跨膜蛋白。交替氧化酶的3级结构还不清楚,原因是交替氧化酶分离后不稳定,很难获得有活性的纯化的蛋白质供其蛋白质晶体学结构分析。因此,目前对交替氧化酶的研究主要集中在分离与纯化的探索。本文的目的是通过大肠杆菌超量表达和从植物提取天然交替氧化酶二个途径探索交替氧化酶的分离和纯化,为其结构和功能的研究打下基础。产热植物枯苞(Sauromattum guttatum)的交替氧化酶基因(AOX)被克隆到分泌表达载体pFLAG-1,携带AOX基因的重组质粒pFLAG-1-AOX转化宿主细胞大肠杆菌DH5α。DH5α在不同温度下培养至不同的细胞密度加入不同浓度诱导物异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG),IPTG诱导AOX基因优化表达。实验表明AOX优化表达条件为:温度37℃,细胞密度OD600=0.6,诱导物IPTG浓度0.2mmol/L。离心分离细胞外培养基蛋白质和细胞蛋白质;渗透压方法破碎宿主细胞,分离可溶的细胞外周质蛋白;提取细胞沉淀物中可溶蛋白质。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质,AOX免疫印迹特异识别亚细胞AOX。亲和层析纯化可溶的外周质AOX融合蛋白。结果显示:优化表达产生少量、分泌到细胞外周质、可溶的AOX融合蛋白和大量不溶的AOX融合蛋白。表达的枯苞(S. guttatum)交替氧化酶为二种形态:相对分子量约为32kDa的还原态单体和分子量约为64kDa的氧化态二聚体。分离斑叶阿若母(Arum maculatum)花序组织线粒体,线粒体保持完整,蛋白质浓度为14.0mg/ml,线粒体AOX呼吸活性为平均耗氧32μmoles/min。用非离子去污剂0.5% dBC把AOX从线粒体膜上溶解下来,AOX酶活性可以恢复70-100%;DEAE交联琼脂糖( DEAE-Sepharose)阴离子交换层析纯化AOX。改进了线粒体分离和AOX溶解纯化方法,即用5mmol/L还原剂二硫苏糖醇(DTT)保持交替氧化酶还原活性态,10mmol/L丙酮酸激活交替氧化酶活性。结果表明,