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大豆是我国重要的粮食作物和经济作物,是高品质蛋白和油脂的主要来源之一。低温、干旱、高盐等非生物胁迫因素严重影响了大豆的产量和品质。因此研究大豆基因在非生物胁迫信号传导途径中的作用,对于改善大豆的非生物胁迫耐受性和增加大豆产量具有非常重要的意义。
NAC(NAM,ATAF1/2,CUC1)基因家族是植物特有的转录因子家族,其蛋白序列的N端具有保守的NAC结构域,迄今为止,有关NAC家族成员生物功能的研究已涉及植物生长发育、生物防御、非生物胁迫反应及细胞形态建成等方面。本研究以栽培大豆(Glycine max)为实验材料,研究NAC类蛋白的生化特性及其与非生物胁迫之间的关系。
根掘NAC基因的结构特点,利用同源比对和拼接的方法,在大豆EST数据库中获得了54个NAC基因类似物。利用RT-PCR方法,从中筛选到15个基因响应一种或多种非生物胁迫信号。
为了研究GmNAC基因在非生物胁迫信号途径中的作用,我们选择了GmNAC11和GmNAC20做进一步研究。结果表明,GmNAC11和GmNAC20被多种非生物胁迫和激素信号诱导;绿色荧光蛋白GFP亚细胞定位分析显示,GmNAC11和GmNAC20均定位于细胞核;凝胶阻滞电泳分析表明,GmNAC11和GmNAC20均可结合CGT[G/A]为基序的DNA序列;利用酵母和原生质体系统分析其转录活性,说明GmNAC11具有转录激活活性而GmNAC20具有转录抑制活性。
进一步在酵母和植物原生质体两种系统中分析了GmNAC20各结构域与转录激活/抑制活性的相关性。发现GmNAC20中有一个具有转录抑制作用的结构域20RD(GmNAC20 Repression Domain)。20RD包含105个碱基,编码35个氨基酸,其中疏水氨基酸的含量达到37.6%。通过形成融合蛋白,20RD可以强烈抑制不同转录因子或转录激活域的转录激活活性。20RD分成区段后,其抑制作用则明显减弱,说明20RD的抑制作用依赖于序列和结构的完整性。Blast在数据库中的搜索表明20RD仅存在于NAC家族中,是一个保守结构域,因此我们克隆了20RD在其他6个NAC基因中的同源序列,实验表明,上述同源序列与20RD一样,也具有转录抑制作用。分别突变20RD中的两段保守序列KK和LVFY,发现疏水氨基酸LVFY的序列和疏水性对20RD的抑制作用非常重要。综上所述,20RD广泛存在于NAC蛋白中,是富含疏水氨基酸的,具有转录抑制作用的调控域。20RD的发现拓展了NAC类基因转录活性调控方式的研究,为深入了解NAC的作用方式奠定了基础。
在拟南芥中过量表达GmNAC11和GmNAC20,发现转GmNAC11的植株的耐盐性明显高于野生型,而转GmNAC20植株不仪提高了耐盐性,其抗冻性也明显提高,同时还促进了侧根的发育。下游基因的表达情况分析发现,GmNAC11调控一些耐逆相关基因的表达,而GmNAC20不仅调控耐逆相关基因的表达也调控一些生长素相关基因的表达。因此GmNAC11和GmNAC20参与了植物耐逆性的调控,而GmNAC20参与调控的非生物胁迫信号通路可能与生长素信号通路有交叉反应。