论文部分内容阅读
柞蚕(Antheraea pernyi)最早在中国山东地区发现并开始养殖驯化,是我国重要的一类野生绢丝昆虫。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)在昆虫的先天免疫中通过与丝氨酸蛋白酶相互制约达到一定的动态平衡,从而调节生物体内很多的生命活动,在昆虫的先天免疫中发挥重要的作用。本文主要研究serpin-1like基因的表达模式和在柞蚕先天免疫中的功能,研究结果如下:本研究利用PCR技术成功克隆并获得一个读码框为837 bp的serpin-1like基因,其含有一个保守的serpin结构域,进化树分析显示其与印度柞蚕亲缘关系最近,同源性高达为82.1%。通过构建原核表达载体pET-28a-Ap-serpin-1like,并经不同浓度IPTG诱导成功获得了重组pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白。大量诱导后使用蛋白纯化柱对重组蛋白进行纯化,得到浓度和纯度都非常高的pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白,蛋白浓度约为0.5mg/ml。以获得的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,通过实验室常规取血方法取血得到Ap-serpin-1like抗体并检测效价约为1:128000。利用PCR技术和Western Blot实验操作方法检测serpin-1like基因在柞蚕五龄三天幼虫的血淋巴、表皮、丝腺、脂肪体、中肠和马氏管中的表达情况,结果表明Ap-serpin-1like在柞蚕中属于组成性表达,在脂肪体中表达最高,在血淋巴中表达量最低。同时利用实时定量PCR技术检测柞蚕不同发育阶段serpin-1like基因的表达情况,发现serpin-1like在蛹期表达量最高,在四龄时候表达量低,其他几个龄期表达差异不显著。随后研究了在四种病原微生物刺激下柞蚕五龄三天幼虫免疫功能所受到的影响。利用实时定量PCR技术分别检测脂肪体、血淋巴和中肠中Ap-serpin-1like基因在病原微生物刺激后的转录表达水平。实验结果表明在三种组织中都能明显上调或下调Ap-serpin-1like的表达。实验发现:在脂肪体中,Ap-serpin-1like除了注射B.bassiana在24-48h下调之外,其他三种菌的各个时间段均表达量上调,但各时间段上调程度有所不同。在血淋巴中,注射B.bassiana和M.luteus,Ap-serpin-1like mRNA表达量在24h达到最高,而注射E.coli在第一个检测时间点1.5 h的时候表达量高于其他的检测时间点。柞蚕的中肠中,表达情况是有所不同的:注射B.bassiana对柞蚕刺激后,Ap-serpin-1like mRNA在48h表达明显高于其他的时间段。注射NPV后Ap-serpin-1like在24h表达水平达到最高。M.luteus诱导后,Ap-serpin-1like的转录水平在1.5h表达量最高。而注射E.coli对Ap-serpin-1like mRNA表达影响较小。综上所述,Ap-serpin-1like在柞蚕的先天性免疫应答中可能有重要的作用和功能,本研究可以为进一步从分子水平上解释丝氨酸蛋白酶抑制剂在柞蚕生理病理过程中对柞蚕免疫所产生的影响,并且也可以为研究丝氨酸蛋白酶抑制剂在其他动物、植物和微生物的各项生命活动中所承担的主要作用的研究提供参考。