论文部分内容阅读
莽草酸途径(shikimate pathway)广泛存在于细菌、真菌以及植物中，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中包含完整的莽草酸途径。本文工作主要围绕谷氨酸棒杆菌中的莽草酸途径开展。通过基因敲除与互补、蛋白质的异源表达以及酶学性质的分析等方法鉴定莽草酸途径以及下游途径中编码基因的功能。基因ncgl0819的编码产物为C.glutamicum ATCC13032中的唯一的分支酸变位酶，命名为CM0819。C.glutamicum ATCC13032中的苯丙氨酸和酪氨酸合成只能通过CM0819催化分支酸生成预苯酸这一途径起始。CM0819是一个单功能分支酸变位酶。通过圆二色谱分析，初步认为CM0819的二级结构主要是由a-helices组成的。此外，通过分支酸变位酶氨基酸序列比对以及系统发育进化树的构建，推测CM0819应该是AroQ型分支酸变位酶的一个新成员。CM0819不受三种芳香族氨基酸Phe、Tyr和Trp的任何反馈抑制作用，同时也是一个不依赖于二价金属离子的蛋白，Mg2+和EDTA对酶活没有明显影响，而Mn2+、Co2+和Ni2+分别对CM0819产生了不同程度的抑制作用。
谷氨酸棒杆菌中存在两个编码DAHP合成酶的基因，即ncgl0950和ncgl2098，其编码产物分别为DS0950和DS2098。DS0950的活力能被低浓度的Tyr明显抑制，Phe和Trp也在一定程度上抑制其活性。Tyr对底物PEP存在竞争性抑制作用，而对底物E4P存在非竞争性抑制作用。此外，通过RT-PCR，检测到ncgl0950在C.glutamicum RES167(衍生于Corynebacterium glutamicum ATCC13032的限制型缺陷菌株)的细胞中是转录的，且在其上游发现了一个可能的核糖体结合位点(5’-AAGG-3’)，但在翻译水平上并未检测到ncgl0950的表达产物(即DS0950)，即DS0950具有DAHP合成酶的酶活，但在C.glutamicum RES167中不参与体内的三种芳香族氨基酸的合成，也不参与莽草酸途径。DS2098与DS0950的性质有很大区别。通过在C.glutamicum RES167不同突变菌株中测定DAHP合成酶酶活，确定了DS2098参与了C.glutamicum RES167中三种芳香族氨基酸的生物合成过程，是C.glutamicum RES167中的DAHP合成酶。DS2098在一定程度上受到莽草酸途径中间产物shikimate的抑制作用，但抑制程度比较低，不受Phe、Tyr和Trp的反馈抑制和反馈阻遏作用。
在谷氨酸棒杆菌中，DS2098和CM0819之间通过范德华力、疏水作用以及氢键的作用，特异性结合形成蛋白质复合物。复合物形成后，可以提高DS的活性，对CM的活性没有明显影响。DS2098和CM0819之间相互作用的界面为DS2098中第212-219位氨基酸残基SPAGARYE、CM0819中C末端的5个氨基酸残基RGKLG以及第60-64位氨基酸残基SGGTR，尤其是前两个区域。CM0819存在时，chorismate和prephenate对DS2098存在协同抑制作用。通过抑制动力学的分析以及抑制系数的测定，证明prephenate是DS2098-CM0819复合物中DS2098的竞争性抑制剂，竞争底物PEP的结合位点。当两蛋白之间的相互作用界面被破坏后，prephenate失去了对DS酶活的抑制作用。DS2098中第387-394位氨基酸残基HFDKVIDE与肽链的折叠有关。该区段发生突变后，蛋白质不能正确折叠，形成包涵体。Ile285、Glu287和Arg288三个氨基酸残基与酶的催化密切相关，发生突变后，DS2098失活。基因ncgl1560编码的蛋白注释为C.glutamicum ATCC13032中的AroK型的莽草酸激酶。在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达NCgl1560，通过酶活测定，证实NCgl1560具有莽草酸激酶酶活。