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[研究背景]帕金森病(Parkinson’s disease)是由锥体外系功能紊乱而导致的一种中枢神经系统退行性疾病。其临床表现为静止震颤,肌肉僵直,运动迟缓和共济失调,严重者伴有记忆障碍和痴呆;帕金森病典型的病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性缺失,纹状体内多巴胺能递质含量显著减少,以及在残存的多巴胺能神经元内,a-synuclein的聚集导致的路易小体的形成。帕金森病的发病机制十分复杂,可能涉及到了氧化应激、炎症损伤、兴奋性神经毒性、线粒体功能障碍及遗传因素等,目前已经提出了多种假说,但至今没有定论。氧化应激及免疫炎症反应在PD多巴胺能神经元损伤中发挥了非常关键的作用。活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的过度产生、固有免疫的过度激活及适应性免疫功能紊乱,会导致多巴胺能神经元处于持续刺激状态,它们共同构成了黑质纹状体多巴胺神经区域的病理微环境,是引起多巴胺能神经元变性损伤的主要机制。然而,迄今为止其上下游分子调控机制仍未得到充分阐明。近年,有研究表明组蛋白乙酰化修饰等表观遗传机制在中枢神经系统的功能调节中发挥着重要作用,影响细胞多方面功能,参与PD的发生发展。组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6，HDAC6)的去乙酰化活性在氧化应激及免疫炎症反应中的作用日益受到重视。HDAC6属于2类HDAC家族,结构独特,包括两个去乙酰化催化域、一个泛素化结合域以及一个动力蛋白结合域。两个去乙酰化催化域(DD1,DD2)是HDAC6的酶活性区域,均有使底物蛋白去乙酰化的活性,其中DD2的功能特征较为明确,是目前HDAC6特异性抑制剂的作用靶位。过氧化氧化还原蛋白Prx是HDAC6的特异性底物。经HDAC6去乙酰化调节后,即去乙酰化的Prx,其抗氧化能力大大降低,细胞死亡率增加,不利于氧化性损伤的防治。由于氧化损伤是帕金森病的重要致病因素,因此,本实验用HDAC6去乙酰化活性特异性抑制剂TubastatinA(TBA),观察在6-OHDA诱导的PD模型中,TBA对HDAC6去乙酰化活性的抑制,以及对氧化损伤的保护作用。除氧化应激外,固有免疫介导的炎症反应也是帕金森病的一个重要的致病因素。NLRP3即NOD样受体属于胞浆内模式识别受体,通过识别受损细胞释放的损伤相关分子模式,激活固有免疫系统、促进炎症并驱动和调节适应性免疫应答。研究表明ROS可以作为一种内源性致病因素,启动NALP3炎性体(inflammasome)装配,进而激活caspase-1,诱导IL-1β、IL-18等前体分子的成熟分泌及细胞死亡,参与非感染性疾病的发生发展,在免疫炎症反应及中枢神经退行性疾病中的作用日益受到关注。本实验采取HDAC6去乙酰化活性的特异性抑制剂TBA,观察在6-OHDA诱导的PD模型中,TBA抑制HDAC6去乙酰化活性后,对NLRP3激活的影响,以及NLRP3激活后,对NLRP3炎性小体的装配、后续相关炎症因子如caspase-1、IL-1β等分子的成熟及分泌的影响。[研究目的]利用TBA特异性抑制HDAC6去乙酰化活性,观察对NLRP3通路的影响及在帕金森病中的作用。[研究方法]体外实验:1.体外培养SH-SY5Y细胞,给予6-OHDA刺激SH-SY5Y细胞,不同时间点收取细胞,western blot观察NLRP3的蛋白表达变化。2.体外培养SH-SY5Y细胞,对SH-SY5Y细胞进行TBA预处理2 h及6-OHDA刺激24 h，western blot观察NLRP3及caspase-1、IL-1β活化体的表达变化。3.体外培养SH-SY5Y细胞,给予不同浓度TBA对SH-SY5Y细胞进行处理,CCK-8观察TBA对细胞的增殖是否有影响,并观察TBA对6-OHDA损伤的细胞是否起到保护作用。4.体外培养SH-SY5Y细胞,对SH-SY5Y细胞进行TBA预处理2h及6-OHDA刺激24 h,流式细胞术及TUNEL荧光染色观察TBA对细胞凋亡是否起到保护作用。5.体外培养SH-SY5Y细胞,制备相应小干扰及过表达质粒,对SH-SY5Y细胞进行沉默或过表达HDAC6分子,验证其沉默或过表达的效率后,流式细胞术观察其对细胞凋亡是否有影响。6.体外培养SH-SY5Y细胞,对SH-SY5Y细胞进行TBA预处理2 h及6-OHDA刺激24 h,免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)观察TBA对Prx-II乙酰化水平的影响,流式细胞术观察TBA对细胞ROS水平的影响。体内实验:1.使用脑立体定位仪对C57BL/6小鼠大脑定位注射6-OHDA制备帕金森病动物模型,第二天开始腹腔注射TBA(25 mg/kg)治疗,每日一次,连续给药7天,末次给药后取小鼠黑质部位冰冻切片进行免疫荧光染色,观察NLRP3和HDAC6在神经元部位的表达。2.使用脑立体定位仪对C57BL/6小鼠大脑定位注射6-OHDA制备帕金森病模型,取小鼠纹状体部位组织,用western blot及real time RT-PCR观察造模后不同时间点NLRP3mRNA及蛋白表达水平的变化。3.使用脑立体定位仪对C57BL/6小鼠大脑定位注射6-OHDA制备帕金森病模型,腹腔注射TBA治疗,取小鼠纹状体部位的组织,用westem blot及real time RT-PCR观察NLRP3、caspase-1、TH、IL-18、IL-1β、IL-6的蛋白或mRNA水平的表达变化。4.使用脑立体定位仪对C57BL/6小鼠大脑定位注射6-OHDA制备帕金森病模型,腹腔注射TBA治疗,取小鼠黑质部位冰冻切片进行免疫荧光染色,观察TBA对星形胶质细胞及小胶质细胞的活化及表达变化的影响,取小鼠黑质部位及纹状体部位冰冻切片进行免疫组化染色,观察TBA对多巴胺能神经元是否有保护作用。5.使用脑立体定位仪对C57BL/6小鼠大脑定位注射6-OHDA制备帕金森病模型,腹腔注射TBA治疗,取小鼠纹状体部位组织,用HPLC-MS检测TBA对DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量的影响。6.使用脑立体定位仪对C57BL/6小鼠大脑定位注射6-OHDA制备帕金森病模型,腹腔注射TBA治疗,取小鼠黑质部位冰冻切片及小鼠纹状体部位组织,使用免疫荧光染色及western blot,观察TBA对4-HNE表达的影响。[实验结果]1.特异性HDAC6抑制剂TBA抑制SH-SY5Y细胞中6-OHDA诱导的NLRP3炎性体活化。2.TBA对HDAC6的药理性抑制可保护6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞,减少6-OHDA所致细胞死亡,敲低或过表达HDAC6对细胞凋亡无影响。3.在6-OHDA诱导的PD小鼠模型中,TBA抑制NLRP3炎性体的活化。4.TBA减轻小鼠PD模型中6-OHDA诱导的多巴胺能神经毒性。5.TBA增强PRX-Ⅱ的乙酰化水平并降低细胞与动物模型内的ROS水平。[结论]TBA特异性抑制HDAC6去乙酰化水平,通过减少氧化应激及炎症损伤,在帕金森病中起到保护作用。