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猪瘟和猪伪狂犬病是严重危害养猪业的重要疫病，抗体滴度的监测是预防和控制这两种病的主要技术手段之一，为建立快速准确的抗体诊断方法，本研究通过PCR扩增了猪瘟病毒疫苗株囊膜E2蛋白A、B、C、D四个主要抗原区651bp的基因序列，扩增猪瘟E0蛋白的全部基因序列795bp，同时扩增猪伪狂犬病毒gB基因708bp的核心抗原区、猪伪狂犬病毒野毒株特异性gE基因621bp的核心抗原区。将上述4种基因的PCR产物其与PGEM-T载体连接，转化DH5α克隆菌株中，提质粒经过PCR、双酶切、测序等鉴定成功后，再次回收目的基因并与原核表达载体pET32a连接，分别构建了PET-32a-E0、PET-32aEK-E2、PET-32a-gB、PET-32a-gE原核表达重组载体。将以上构建好的重组载体转入大肠杆菌表达菌株中进行表达，其中，PET-32a-E0、PET-32aEK-E2转化BL21（DE3）plys菌株，PET-32a-gB、PET-32a-gE转化BL21（ED3）菌株，通过调整表达温度和IPTG的工作浓度获取最佳蛋白表达量，经SDS-PAGE电泳检测显示，在37℃、IPTG浓度为0.5mM、诱导5h时E0、E2、gB与gE基因的蛋白表达量最高。利用His·BindPurficationKit纯化上述表达的蛋白，结果显示当咪唑浓度为1M时蛋白纯化效果最好。用BCA法测定蛋白浓度分别为0.0714mg/ml、0.1159mg/ml、0.1449mg/ml、0.0725mg/ml。 分别用纯化后的E0、E2、gB与gE蛋白作为包被抗原，通过抗原包被量、抗原包被条件、血清稀释度、封闭条件、血清孵育时间、二抗孵育时间、显色时间等条件的优化，最终确定最佳反应条件为：E0、E2、gB与gE等纯化的抗原系列稀释，每孔包被量分别为0.625μg、0.625ug、0.15625ug与0.625ug，4℃用碳酸盐缓冲液包被12h，0.25%PVA溶液37℃封闭2h，5%脱脂奶粉封闭30min，待检血清1:100倍稀释后，37℃反应45min，再将HRP标记的兔抗猪二抗稀释10000倍，加入孔中37℃反应30min，加入TMB显色液避光室温显色15min，最后用终止液终止反应，测定OD450值。以上述条件分别对猪瘟抗体与猪伪狂犬抗体24份阴性血清样品进行检测，对检测结果进行分析计算数据平均值（X）与标准方差（SD），并确定阴阳性判定标准的临界值，当OD450值≥X+3SD时判定为阳性，OD450值≤X+2SD时判定为阴性，OD450值界于两者之间时则判定为可疑，可以复检或重新取样检测。E0蛋白构建的间接ELISA检测方法当检测OD450值≥0.24时判定阳性，OD450值≤0.2时判定为阴性，OD450值界于0.24～0.2时则认为可疑。E2蛋白构建的间接ELISA检测方法当检测OD450值≥0.33时判定为阳性，OD450值≤0.27时判定为阴性，OD450值界于0.33～0.27时则认为可疑。gB蛋白构建的间接ELISA检测方法当检测OD450值≥0.28时判定为阳性，OD450值≤0.22时判定为阴性，OD450值界于0.28～0.22时则认为可疑。gE蛋白构建的间接ELISA检测方当检测OD450值≥0.27时判定为阳性，OD450值≤0.22时判定为阴性，OD450值界于0.27～0.22时则认为可疑。 对建立起来的两种间接ELISA检测方法进行批内和批间重复性实验。结果显示批内批间实验组变异系数（CV）均小于10%，而阴性对照与空白对照的变异系数（CV）有的高于10%，这可能是由于数值低造成变异系数变大的结果，由以上数据可知本研究的ELISA方法具有良好的重复性。按照此方法探索抗原的特异性，分别对猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪口蹄疫O型(FMDV-O)三种猪常见疾病的阳性抗体血清进行检测，其OD450值均小于阴性临界值：E0为0.2、E2为0.27、gB为0.22、gE为0.22，证明猪瘟抗体与猪伪狂犬抗体间接ELISA检测方法具有很好的特异性。利用此方法与两家商品化猪瘟抗体检测试剂盒和猪伪狂犬gB、gE抗体检测试剂盒同时对94份临床血清样本进行检测。检测结果显示，E0、E2、gB与gE的阳性符合率分别为64.44%、68.89%、62.22%、65.71%，阴性符合率为86.67%、82.22%、86.67%、81.82%，由以上数据可知本研究构建的ELISA方法具有良好的特异性但在敏感性上存在问题，可能存在的原因是没有表达出核心抗原区的蛋白。本研究最终建立了猪瘟抗体与猪伪狂犬抗体间接ELISA检测方法并研制成功相应的检测试剂盒。