论文部分内容阅读
本研究采用兔胚胎作为试验对象，从中分离克隆出兔类ES细胞，而且系统地比较了不同的培养条件对兔类ES细胞分离培养的影响，并对其进行了传代培养及鉴定；采用不同浓度的视黄酸（retinoic acid, RA）对分离到的兔类ES细胞向原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）诱导分化效果进行了初步探讨，为兔胚胎干细胞的建系及向原始生殖细胞的体外分化研究奠定了基础。试验主要结果如下：1.探讨超数排卵对兔胚胎体外发育能力的影响，收集自然发情和超数排卵处理配种后4d的胚胎，接种于MEF饲养层上培养，以自然发情交配所得兔囊胚作为对照。结果如下：超数排卵组的胚胎贴壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然发情组，但没有显著差异（P>0.05），兔超数排卵对兔胚胎的体外发育能力没有显著影响。但在干细胞克隆传代方面差异显著（P<0.05）。因此，为保证试验的效率，尤其在严寒和酷热的环境下，兔子自然交配不易成功，对母兔采取超排方式可获得足够的胚胎，但在春秋季节时获得胚胎以自然发情交配为好，其胚胎更适宜分离胚胎干细胞。2.探讨兔胚胎的不同处理对兔胚胎克隆、传代的影响。将自然发情获得的挑破透明带胚、离散胚和未处理胚分别置MEF饲养层上培养。结果显示：挑破透明带法和胚胎分割法较对照组得到的胚胎更容易贴壁和增殖，有显著差异（P<0.05），虽然离散胚组的胚胎贴壁率（85.7%）显著高于挑破透明带组（70.0%）（P<0.05），但挑破透明带组的ICM形成率（53.3%）高于离散胚组（40.0%）（P<0.05），挑破透明带组F1、F2代兔类ES细胞的克隆率分别为34.7%和25.7%，均显著高于其他两组（P<0.05），最高传至30代。因此，挑破透明带有利于提高从兔胚胎中分离胚胎干细胞的效率，能更好的支持兔类ES细胞的培养与增殖。3.探讨不同培养基对兔胚胎克隆和传代的影响。结果显示：胚胎在含15%FBS的培养液中ICM集落形成率以及1~5代类ES细胞传代过程中均显著高于其他两组含15%KSR和7.5%FBS+7.5%KSR的培养液（P<0.05），培养液为高糖-DMEM+2mmol/L L-谷氨酰胺+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+1%NEAA+15%FBS+100IU/mL双抗时改善了兔类ES细胞的体外培养环境，有利于兔类ES细胞集落的形成，能够进行稳定的传代。4.探讨了机械消化传代、胰酶消化传代和“机械+胰酶”消化传代3种不同的传代方法对兔类ES细胞分离培养传代的影响，结果发现“机械+胰酶”消化传代法最有利于兔类ES细胞传代和集落的形成，细胞克隆形态最佳，为理想的ES细胞分离传代方法。5.将分离克隆得到的兔类ES细胞进行鉴定，结果显示，碱性磷酸酶染色和Oct-4、Nanog免疫荧光鉴定兔类ES细胞集落均呈阳性；提取兔类ES细胞集落的RNA，扩增多能性基因Sox2、Nanog和GAPDH经RT-PCR检测，得到了与预期大小一致的目的片段。体外分化形成具有三个胚层构成的类胚体（embryoid bodies, EBs）。6.探讨不同浓度的RA对兔类ES细胞向原始生殖细胞诱导分化的能力。采用不同浓度RA（0.2μM、2μM、20μM）诱导液和不加RA的培养液对兔类ES细胞进行诱导，用流式细胞仪进行DNA倍体分析，结果显示：0.2μM浓度RA诱导21d经DNA倍体分析单倍体含量达54.4%，诱导效率最高，2μM浓度RA诱导14d经DNA倍体分析单倍体含量达12.6%，而其他浓度在诱导了相同天数则不含单倍体，说明兔类ES细胞可以用RA向原始生殖细胞诱导，0.2μM浓度的RA诱导效率要比其他浓度高，表明RA的较佳浓度为0.2μM。