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蛋白质巯基亚硝基化修饰(S-nitrosation or S-nitrosylation)是指一氧化氮及其衍生物对蛋白质半胱氨酸自由巯基的修饰，将-SH转变为-SNO，是一种典型的氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰，是一氧化氮除了经典的cGMP通路之外，在体内行使功能的又一种重要形式。这种氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰广泛参与许多生理和病理过程中的多条信号通路的调控。目前的研究多是利用细胞分子生物学方法研究单蛋白巯基亚硝基化靶点的功能。随着蛋白质巯基亚硝基化研究的不断拓展和深入，人们越加关注蛋白质巯基亚硝基化修饰的生理功能；而内源情况下蛋白质巯基亚硝基化的水平较低，已有的检测蛋白质巯基亚硝基化的蛋白质组学方法还停留在定性的水平，因此亟需一种适用于内源模型定量检测巯基亚硝基化的蛋白质组学方法。
本研究中，我们结合本实验室建立的尿素体系的生物素转化法(Urea-basedBiotin-switch Assay)和细胞培养过程中的氨基酸稳定同位素标记方法(SILAC：Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture)成功建立了定量检测内源巯基亚硝基化的组学方法ESNOQ(Endogenous SNO Quantification)，并首次进行了细菌脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)诱导的RAW264.7细胞和缺氧诱导的HeLa细胞中内源巯基亚硝基化的定量组学分析。我们把带有轻、重稳定同位素标记的氨基酸通过细胞代谢分别掺入细胞，对外源GSNO处理的样品进行定量检测，确认了该方法定量的可靠性与准确性。在LPS和IFN-γ共刺激的RAW264.7细胞模型中，得到了43个亚硝基化蛋白靶点上的47个巯基亚硝基化位点的定量信息，亚硝基化升高范围主要在1.5-9.5倍之间，其中有30个新的内源亚硝基化蛋白靶点。聚类分析表明：巯基亚硝基化的蛋白靶点主要富集在细胞合成代谢、翻译和糖酵解过程。利用该定量方法，我们首次发现同一蛋白的不同亚硝基化位点亚硝基化程度不同，为巯基亚硝基化修饰的不同敏感性和特异性提供了直接证据。
在缺氧诱导的HeLa细胞模型中，检测到了6个亚硝基化的靶点和3个去亚硝基化的靶点，其中，分子伴侣ERO1在其活性位点Cys131上的亚硝基化水平在缺氧处理后升高了约十倍。ERO1α和PDI(二硫键异构酶)协同，具有调控内质网氧化还原水平的功能，Cys131巯基的存在是ERO1α发挥这一功能的必要条件。这一结果提示ERO1α可能是缺氧诱导的HeLa细胞模型中蛋白巯基亚硝基化发挥调控功能的重要靶点。在获得了轻重同位素掺入的HeLa细胞之后，我们还利用SILAC方法对缺氧诱导的HeLa细胞模型进行了蛋白表达谱的定量组学分析。经过数据的处理和验证，共得到了1504个蛋白的表达量变化信息，进一步的分析还在进行中。
本研究首次建立了定量检测内源蛋白质巯基亚硝基化组学方法(ESNOQ)。它的主要特点是：适用内源模型、定量准确、有位点信息和一定的通量。这些特点对于亚硝基化的机理研究及功能研究都具有重要意义。我们建立的检测方法还具有可扩展性，可通过引入不同质量数的多种同位素标记来增加检测的组别，从而进行蛋白质亚硝基化修饰的动态研究。ESNOQ方法的建立使得生理和病理过程中多靶点内源蛋白质巯基亚硝基化修饰的功能研究和动态变化研究成为可能；两个内源模型的蛋白质巯基亚硝基化定量研究的结果也为下一步的深入研究奠定了基础。