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糖在植物体内不仅作为碳源和能量来源,同时也具有与激素相似的生物信号的作用,糖信号在植物的整个生命周期中调控其生长和发育。借助对拟南芥突变体的分析,人们对糖信号在植物体内的感受和转导过程有了很多的了解。但是植物对糖响应的详尽分子机理及其如何和其他信号途径相互作用来调控植物的生长发育还知之甚少。本论文对一个对糖表现超敏感的突变体(h)yper(s)ensitive to(s)ugar-1(hss-1)进行了分析和鉴定。突变体hss-1在不同发育时期的外部形态与野生型对照比较都存在非常显著的差异。如植株鲜重、株高、茎粗等都明显小于野生型;相对于野生型平整的叶片,hss-1有部分叶片出现明显的折褶;同野生型相比,hss-1角果明显变短,每个角果里的种子数目大幅度下降,而种子却显著大于对照,百粒重增加。遗传分析表明,野生型与突变体杂交后F2代分离比符合3∶1比例,说明突变表型是由核内的单基因控制的、基因隐性遗传。对杂交后F2代单株进行纯杂合鉴定的结果证明了基因与突变表型相互连锁。对突变体hss-1相关生理指标检测发现突变体幼苗中叶绿素含量下降、花青素含量上升。可溶性糖和淀粉含量也明显高于野生型对照。
随后通过TAIL-PCR的方法克隆了突变相对应基因HSS。对其序列分析发现,T-DNA插入在基因座位AT3G12300第3个内含子中,即拟南芥基因组序列起始密码子ATG开始第715bp处。数据库注释表明HSS是一未知功能的基因,它编码190个氨基酸的小蛋白,等电点9.09。编码蛋白在真核生物中以单拷贝的形式普遍存在,并且氨基酸序列高度保守。对突变体hss-1中基因HSS的表达检测表明,T-DNA插入造成了基因转录提前终止。
启动子预测分析发现HSS基因可能参与ABA、生长素及盐等外界胁迫响应。因此,在种子萌发和幼苗形态建成两个时期对突变体hss-1在糖、激素和盐等不同处理条件下的反应进行了鉴定。结果表明,代谢糖(蔗糖和葡萄糖)可以造成突变体种子萌发和幼苗生长相对于野生型明显受抑制,而非代谢糖(甘露醇和甘露糖)没有这样的功效,证明了基因HSS是以不依赖于已糖激酶途径的糖信号转导途径参与到生物调节过程的。激素的处理结果发现,突变体hss-1对ABA、生长素也表现出过敏感现象,种子萌发和幼苗生长相对于野生型对照明显的受抑制,而突变体对赤霉素处理的反应与野生型相似。突变体hss-1对NaCl处理也呈现明显的发育迟滞现象。基因突变造成的这种多效表现暗示着它在植物体内担负着至关重要的功能。
基因表达分析表明HSS在拟南芥植株的各器官中都有表达,但在叶中表达较强,茎中较弱。该基因受渗透胁迫、盐胁迫和激素ABA、IAA处理的微弱诱导。但是作为糖信号相关基因,它在转录水平上却不受糖的诱导或抑制。然而,通过检测糖信号下游基因的表达发现,突变体中基因APL3、CHS和PAL受糖强烈诱导,而STP1受糖抑制,进一步说明基因HSS参与糖的响应途径为不依赖于HXK糖信号途径。通过对ABA相关基因的检测发现,ABA3和NECD3在突变体中的表达水平高于野生型对照,有糖和无糖的情况表现一致,说明该基因负向调控ABA的合成。加糖处理后,基因ABI3、ABI4、ABI5的表达在突变体中被明显的上调。结合ABA相关突变体abi1-5中基因HSS1的表达没有发生改变的结果,我们推断基因HSS在ABA和糖信号途径的上游发挥作用。hss-1突变体抽薹开花延迟,检测开花相关基因的表达发现:基因CO,LFY和FT在突变体中不同程度的被抑制,而SOC没有发生变化。提示基因HSS突变可能影响了植物开花过程中的信号转导途径,从而抑制了下游的关键基因表达来调控植物抽薹开花进程。
利用酵母体内实验初步证明基因HSS编码蛋白不具有转录因子的2个基本特征:两聚化和转录激活功能,所以它可能并不像推测的那样是一个转录因子。GFP融合蛋白亚细胞定位分析确定了蛋白HSS定位于细胞核内,糖和ABA的处理提高了蛋白的表达丰度并可能引起了蛋白的核外转运。因此,糖和ABA很可能也通过在转录后水平上调控HSS来调节植物的生长发育。
通过上述研究,我们发现了一个调控ABA和糖信号途径的重要调控基因。为进一步研究和揭示植物ABA和糖信号途径相互作用调控植物发育的分子机理提供了新思路。
蛋白EIN2作为植物乙烯信号转导途径中一个重要组件,在介导各种植物激素信号途径的相互作用中扮演着重要的角色。ABA和乙烯都被誉为胁迫激素。已知ABA可以介导植物对外界胁迫的响应,但乙烯信号途径是否参与植物对外界非生物胁迫响应以及它调控植物对逆境的响应的分子机理均不清楚。在本课题中,我们首先证明了乙烯信号途径中的关键基因EIN2是以依赖激素ABA的信号途径来参与和调节拟南芥对外界渗透及盐胁迫的响应过程。EIN2基因的表达受盐和渗透胁迫的下调。拟南芥功能缺失突变体表现出对盐和渗透胁迫的高度敏感性。EIN2基因的敲除专一性地改变了胁迫相关的下游基因RD29B的表达模式,但对其它两个与胁迫和ABA响应有关的基因RD29A和RD22没有造成影响,说明EIN2基因是通过ABA信号途径的RD29B支路来调节植物的胁迫响应过程。而且EIN2基因的突变,也造成了植物体内的ABA含量显著下降。
此外,我们还发现乙烯信号转导通路上的其它组件基因的突变也会引起拟南芥植物对非生物胁迫的敏感性显著变化,说明整个乙烯信号通路都参与了植物的胁迫响应过程。我们的研究结果证明EIN2很可能是作为乙烯、ABA和胁迫信号转导途径的中心节点,在拟南芥种子萌发、幼苗形态建成及随后的营养生长阶段中遭遇外界胁迫时能够诱导植物生长发育的停滞,从而使植物体能够存活与生长。