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液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有高灵敏度、高选择性、宽定量动态范围等特点，是复杂基质中多组分分析的有效工具，被广泛应用于药物动力学研究。本课题以匹可硫酸钠和甲磺酸氟马替尼为研究对象，建立了LC-MS/MS分析方法同时测定血浆中原形药物及其主要代谢产物。分析方法经过方法确证后，应用于两种药物的人体药动学研究。 一、LC-MS/MS法同时测定人血浆中匹可硫酸钠及其主要代谢产物 匹可硫酸钠(PICO-Na)是一种多酚类刺激性缓泄剂。在肠道内细菌作用下，水解为活性成分苷元BHPM，后者在体内可进一步代谢为单葡萄糖醛酸结合物(M1)和单硫酸结合物(M2)。PICO-Na已临床应用30多年，但人体主要代谢产物、药动学性质及吸收情况未见报道。为了研究PICO-Na的人体药动学，本文采用了化学和生物学方法合成了主要代谢产物对照品M1、M2及各自的稳定同位素标记的内标物。建立了灵敏、专属的LC-MS/MS法，同时测定血浆中PICO和主要代谢产物，并对建立的方法进行确证。血浆样品经乙腈沉淀蛋白后，由Luna5uC18(2)色谱柱进行分离。PICO和M1为硫酸酯，M2为葡萄糖苷酸结合物，为避免质谱分析时源内裂解峰对彼此定量产生的干扰，本实验采用了流动相为乙腈-10mM醋酸铵的梯度洗脱法实现各待测物色谱基线分离。配备电喷雾电离源(ESI)的串联质谱进行检测。在正离子模式下进行多反应检测(MRM)，定量离子对分别为m/z438.1→m/z278.1(PICO)、m/z278.1→m/z184.2(BHPM)、m/z454.1→m/z184.2(M1)和m/z358.1→m/z(184.2+278.1)(M2)。各待测物的内标物均选用各自的氘取代化合物，提高了方法的重现性。PICO、BHPM、M1和M2的线性范围分别为0.150-40.0、0.600-160、0.150-40.0和0.045-12.0ng/mL，精密度(RSD)在3.5％～9.8％之间，准确度(RE)在-6.7％～3.7％之间。经确证的方法可应用于PICO-Na的临床药动学研究。 二、匹可硫酸钠人体药代动力学研究 为了研究匹可硫酸钠及其主要代谢物的药动学性质，阐明结合型代谢物高暴露的原因，本文进行了如下实验。体内实验：1)12名健康受试者单次口服5mgPICO后，采集不同时间点血浆样品，采用LC-MS/MS法测定原形药物和代谢产物的浓度；2)12只大鼠随机分为四组，分别灌胃给予4.81mg/kgPICO-Na、肝门静脉给予4.81mg/kgPICO-Na、灌胃给予2.77mg/kgBHPM和肝门静脉给予2.77mg/kgBHPM。体外实验：1)PICO-Na在不同pH缓冲液中稳定性实验；2)：BHPM在肝、肠细胞S9成分结合代谢实验；3)Caco-12细胞渗透性实验。 12名健康受试者单次口服5mgPICO-Na后，循环系统主要检测到母体药物PICO、BHPM单葡萄糖醛酸结合物M1及BHPM单硫酸结合物M2。PICO、M1和M2的AUC0-36h值分别为130、2512和14.2ng/mL·h。M1达峰时间为13.6±7.4h，明显晚于PICO的达峰时间(3.8±1.4h)。M2的药物浓度.时间曲线显示双峰，而且达峰时间分别与PICO和M2一致。大鼠肝门静脉给予2.77mg/kgBHPM后，BHPM、M1和M2的血浆暴露比为1:23:1.5，但在灌胃给药组，这个比例为1:407:1.3。这一结果表明了M1主要由肠道的首过代谢生成。大鼠分别灌胃给予等摩尔的PICO-Na或BHPM，PICO-Na组M2的AUC0-t值为BHPM组的1.5倍，提示M2部分源于苷元的结合。将PICO-Na与pH1水溶液孵化，生成了少量的M2，证明M2可以通过PICO-Na胃酸水解生成。Caco-2细胞渗透性实验证明，PICO可以通过肠上皮细胞，但通透性低于M2和苷元BHPM。这也是PICO的系统暴露量较低的原因。BHPM与肝、肠S9孵化后，仅在肝S9孵化体系中检测到M2。综上所述，口服PICO-Na后，其经历了广泛的首过代谢。在胃中PICO-Na可以部分水解产生M2，随后同原形药物直接吸收入血。剩余的PICO-Na进入肠道后被水解为BHPM，并被大量吸收。BHPM在通过肠壁时发生葡萄糖醛酸化生成M1。未被肠道代谢的BHPM在肝脏中会进一步结合代谢为M1和M2，随后进入循环系统。 三、LC-MS/MS法同时测定患者血浆中氟马替尼及其主要代谢产物 甲磺酸氟马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，临床上用于治疗慢性粒细胞白血病(CML)。其在循环系统的主要代谢产物为N-去甲基氟马替尼M1和酰胺水解产物M3。为了研究氟马替尼在CML患者体内的药动学，本文建立简单、快速、选择性高的LC-MS/MS法同时测定患者血浆中氟马替尼及其主要代谢产物，并对方法进行了确证。 血浆样品经甲醇沉淀蛋白后，由C18色谱柱，以甲醇-5mM醋酸铵-甲酸(60：40:0.4，v/v/v)为流动相，等度洗脱进行分离。原形药物和代谢产物均获得较好的色谱保留，色谱运行时间为4.2min。监测模式为多反应监测(MRM)，氟马替尼、M1、M3和内标HHGV-E的定量反应离子对分别为m/z563→m/z463、m/z549→m/z463、m/z303→m/z175和m/z529→m/z429。氟马替尼、M1和M3的线性范围分别为0.400-400、0.100-100和0.200-200ng/mL。血浆用量仅为50μL。氟马替尼、M1和M3的日间日内精密度(RSD)均小于10.6％，准确度(RE)在±9.9％范围内。经过确证的方法成功的应用于CML患者口服400mg甲磺酸氟马替尼片的临床药动学研究。 CML患者口服400mg甲磺酸氟马替尼片每日一次连续28天，氟马替尼、M1和M3的Cmax分别为72.1、11.4和8.67ng/mL；Tmax分别为3.00、1.92和2.33h；T1/2分别为21.8、33.2和21.8h；稳态血浆暴露量AUC24h分别为804、117、92.1ng·h/mL。氟马替尼、代谢物M1和M3在人血浆中无明显蓄积。代谢物M1的稳态血浆暴露量约为原形药物15％左右；代谢物M3的稳态血浆暴露量约为原形药物的10％左右。