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在以清洁可持续能源为主题的社会背景下，丙酮丁醇发酵(ABE)生产丁醇无疑是一种绿色的生物质能源生产方式。在ABE发酵过程中，Ca2+能够提高丁醇生产菌株的抗逆能力，并能显著提高丁醇的产量。Ca2+的信号传导以及相关钙离子结合蛋白(Calcium BindingProteins，CaBPs)在真核生物中研究十分广泛，但在细菌中的研究报道较少。为了探讨Ca2+对产溶剂梭菌的影响机制，本文利用生物信息学方法对Clostridium acetobutylicum ATCC824进行蛋白质组学分析，预测可能存在的CaBPs，并对具有Ca2+结合位点的anti-sigmaⅠ又名RsgⅠ与上游的sigmaⅠ又名SigⅠ、Ca2+的相互作用进行了初步探讨。
(1)总结了CaBPs的Ca2+结合结构域的氨基酸基序(motif)，如EF-hand结构，RTX毒素蛋白家族(Repeats in the structural toxin，RTX)中存在的β-roll序列重复结构、βγ-晶状体蛋白中的“希腊钥匙”(Greek key)结构域和类似免疫球蛋白(proteins withimmunglobulin-like，ig-like)的细菌蛋白质可称之为Big结构域等。生物信息学分析表明，C.acetobutylicum ATCC824蛋白质组有228个可能的CaBPs。利用GO注释在生物过程、细胞组分和代谢过程对蛋白质进行了功能分类。KEGG代谢通路分析表明，这些蛋白质主要参与代谢途径、生物抗性基因合成、次级代谢物生物合成和信号传导等过程。通过分析表明以上CaBPs参与淀粉与蔗糖代谢通路的蛋白质有4个，分别是Q97LJ9、Q97KK6、Q97KK5和Q97F62。此外，Q97182（编码anti-sigma因子即RsgⅠ）具有1个伪EF-hand结构，该蛋白可能参与调节碳源的利用。分析表明该蛋白是一个跨膜蛋白，1个跨膜螺旋与1个胞内结构域，与上游的SigⅠ(Q97183)蛋白质形成1对sigma因子。
(2)Sigma因子是一类协助RNA聚合酶启动转录的调节因子，通过大肠杆菌异源表达SigⅠ和RsgⅠ，并鉴定其相互作用以及RsgⅠ与Ca2+的亲和能力。RsgⅠ-ND（RsgⅠ蛋白质N端结构域）、RsgⅠ-CD（RsgⅠ蛋白质C端结构域）、SigⅠ蛋白质均采用pCold-TF及其衍生载体pCold-TFX或者pGEX-6p-1载体表达，通过Ni-NTA亲和层析或者GST亲和树脂纯化蛋质，共表达纯化6个蛋白，分别是重组融合蛋白TF-SI、GST-SI、TF-ND、TF-CD与对照蛋白TF、GST。通过分子筛分析其相互作用，从蛋白流出时间判断两者具有相互作用，但结果不太明显;GST pulldown结果表明SigⅠ与RsgⅠ具有较强的相互作用。EMSA试验验证TF-CD在Ca2+存在的情况下迁移速率较快，表明RsgⅠ是一个CaBPs。
本研究通过生物信息学方法预测了C.acetobutylicum中可能存在的CaBPs，并从中分析一个可能是CaBPs的RsgⅠ调节因子，并对RsgⅠ因子进行了部分功能研究，这些结果为研究C.acetobutylicum中的Ca2+调节作用机制提供了依据，为进一步理解sigma因子在C.acetobutylicum中的信号传导机制奠定了基础，为构建丁醇高产菌株提供一定的理论观点与实验依据。
(1)总结了CaBPs的Ca2+结合结构域的氨基酸基序(motif)，如EF-hand结构，RTX毒素蛋白家族(Repeats in the structural toxin，RTX)中存在的β-roll序列重复结构、βγ-晶状体蛋白中的“希腊钥匙”(Greek key)结构域和类似免疫球蛋白(proteins withimmunglobulin-like，ig-like)的细菌蛋白质可称之为Big结构域等。生物信息学分析表明，C.acetobutylicum ATCC824蛋白质组有228个可能的CaBPs。利用GO注释在生物过程、细胞组分和代谢过程对蛋白质进行了功能分类。KEGG代谢通路分析表明，这些蛋白质主要参与代谢途径、生物抗性基因合成、次级代谢物生物合成和信号传导等过程。通过分析表明以上CaBPs参与淀粉与蔗糖代谢通路的蛋白质有4个，分别是Q97LJ9、Q97KK6、Q97KK5和Q97F62。此外，Q97182（编码anti-sigma因子即RsgⅠ）具有1个伪EF-hand结构，该蛋白可能参与调节碳源的利用。分析表明该蛋白是一个跨膜蛋白，1个跨膜螺旋与1个胞内结构域，与上游的SigⅠ(Q97183)蛋白质形成1对sigma因子。
(2)Sigma因子是一类协助RNA聚合酶启动转录的调节因子，通过大肠杆菌异源表达SigⅠ和RsgⅠ，并鉴定其相互作用以及RsgⅠ与Ca2+的亲和能力。RsgⅠ-ND（RsgⅠ蛋白质N端结构域）、RsgⅠ-CD（RsgⅠ蛋白质C端结构域）、SigⅠ蛋白质均采用pCold-TF及其衍生载体pCold-TFX或者pGEX-6p-1载体表达，通过Ni-NTA亲和层析或者GST亲和树脂纯化蛋质，共表达纯化6个蛋白，分别是重组融合蛋白TF-SI、GST-SI、TF-ND、TF-CD与对照蛋白TF、GST。通过分子筛分析其相互作用，从蛋白流出时间判断两者具有相互作用，但结果不太明显;GST pulldown结果表明SigⅠ与RsgⅠ具有较强的相互作用。EMSA试验验证TF-CD在Ca2+存在的情况下迁移速率较快，表明RsgⅠ是一个CaBPs。
本研究通过生物信息学方法预测了C.acetobutylicum中可能存在的CaBPs，并从中分析一个可能是CaBPs的RsgⅠ调节因子，并对RsgⅠ因子进行了部分功能研究，这些结果为研究C.acetobutylicum中的Ca2+调节作用机制提供了依据，为进一步理解sigma因子在C.acetobutylicum中的信号传导机制奠定了基础，为构建丁醇高产菌株提供一定的理论观点与实验依据。