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第一部分，目的：
Graves病(GD)是自身免疫甲状腺病(Autoirnmunethyroiddisease,AITD)之一,遗传因素与环境因素的相互作用导致该病的发生。遗传因素在本病的发生中起重要作用:单卵孪生子的患病一致率显著高于异卵孪生子,GD的发生呈明显的家族聚集性。但是,单卵孪生子的患病一致率仅为22%,提示环境因素在本病的发生中也起重要作用。可能的环境因素包括:吸烟、感染、碘摄入量、应激因素等。
遗传易感性在GD的发病中必不可少,但是环境因素在控制遗传易感个体是否发展为临床GD占有同样重要的地位。一些影响因素已得到研究者的证实,如:较早,研究者们便发现:女性发生AITD的危险性是男性的5-10倍;甲状腺功能异常的发生率随着年龄的增加而增加;碘过量能提高GD的发病率,使复发率增加和缓解率下降;对于GD遗传易感个体,吸烟可增加其患病的危险性等等。同时,甲状腺自身抗体及患者治疗方法的选择对GD发生发展的影响同样重要。
GD多发家系成员是仅次于孪生子的遗传易感性研究的最佳人群,国内外都有研究者对这一人群做过相关的研究,但GD多发家系成员其甲状腺功能及相关抗体的随访研究尚未见报道。2000年本研究组共收集了54个GD多发家系,322名成员,经过8年的自然过程,2008年我们对这一人群进行随访研究,以了解环境因素、甲状腺相关抗体及治疗方法对GD患者的疾病转归情况和家系成员的发病情况的影响。
对象与方法：
2000年本研究组对辽宁省10个市县内的54个GD多发家系322名成员进行了甲状腺疾病的流行病学研究,其中GD患者139人,一级亲属183人。2008年对这一人群进行了随访研究,对全部受试者均做详细的甲状腺疾病病史(包括用药史、吸烟、碘盐摄入等情况)的问卷调查和体格检查。采集清晨空腹血、尿标本。血尿标本收集后立即置于冰盒中,并于采样当日将分装的血清和尿样冻存于-70℃冰箱。待全部标本收集完毕后集中测定血清促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb),GD患者测促甲状腺素受体抗体(TRAb),甲状腺刺激抗体(TSAb),甲状腺刺激阻断性抗体(TSBAb)。
应用SPSS11.5软件处理和分析数据。正态分布的计量资料,以mean±SD表示,两组之间的比较采用独立样本t检验,方差齐同的多组比较采用方差分析(S-N-K)。偏态分布的计量资料,以中位数和四分位数间距表示,转换为对数形式后近似正态分布,再行统计分析。TPOAb、TgAb、TBII尿碘以中位数表示,选用秩和检验(Mann-WhitneyU或KruskalWallisH)。计数资料:用率表示,率的比较采用卡方检验,分别选用Pearson卡方、连续性校正卡方或Fishers确切概率法。有显著差异者,再计算比值比(OR)及其95%可信限。多因素分析采用logistic回归分析。P＜0.05判定为具有显著性差异。
结果：
1、将选择药物治疗的70例GD患者分为复发组与无复发组。TRAb浓度无论初访(p＜0.01)还是随访(p=0.000)复发组均显著高于无复发组。TSAb活性初访(p＜0.05)及随访时(p=0.000)同样复发组明显高于无复发组,并且TSAb阳性率在初访时也明显高于无复发组(p＜0.05)。Logistic回归分析后:随访时TRAb阳性(OR=2.644,95%CI=1.276-5.478,P=0.009)为GD患者药物治疗后复发的危险因素。
2、随访发现一级亲属的TSH异常升高(TSH＞4.8mU/L)的发病率显著高于普通人群(p＜0.05),并且77.8%TPOAb或TgAb为阳性。
3、一级亲属中,无论初访还是随访,吸烟组均较非吸烟组的TSH水平降低而FT4水平升高,FT3与初访水平相似。初访及随访时非吸烟组TPOAb,TgAb的阳性率均高于吸烟组,并且随访时有明显的统计学意义(p＜0.05)。吸烟组随访时TRAb水平较初访时有明显的升高(p＜0.01)。
4、将随访到的一级亲属,按照甲状腺功能是否发生变化分为甲功异常组和甲功正常组,比较两组间甲状腺自身抗体(TPOAb、TgAb、TRAb)浓度和阳性率以及TSAb和TSBAb的活性和阳性率,我们发现无论初访还是随访异常变化组的TPOAb及TgAb浓度及阳性率均显著高于无变化组(p＜0.01),TRAb阳性率随访时异常变化组明显高于无变化组(p＜0.05),并且其中TSAb活性在随访时异常变化组明显高于无变化组(p＜0.01)。Logistic回归分析后:初访时TPOAb阳性(OR=10.434,95%CI=2.130-51.104,P=0.004)为GD家系成员发生甲状腺功能异常变化的危险因素。
结论：
1.甲状腺自身抗体在GD多发家系一级亲属发生甲状腺功能异常中起着重要作用。
2.遗传因素在包括GD的自身免疫性甲状腺病(AITD)的发生发展中发挥重要作用,而遗传因素可能通过影响自身免疫系统而最终导致甲状腺功能的改变或影响甲亢治疗后的转归情况。
3.吸烟与TPOAb/TgAb负相关,但可能导致或加重GD。
第二部分， 目的：
Graves病(GD)为多基因遗传病,遗传因素在发病过程中起着重要作用,GD的发生呈明显的家族聚集性,患者同胞的患病危险性为普通人群的15倍,同卵双生子的患病一致率明显高于异卵双生子。在甲状腺功能正常的个体中,甲状腺自身抗体的出现被认为是甲状腺免疫疾病的早期标志,而甲状腺自身抗体的阳性率在AITD一级亲属中明显高于普通人群,这一现象与遗传因素有关。
目前的研究所获得的GD易感基因主要分两类:一类为免疫调控基因:HLA-DR,CD40.CTLA-4和PTPN22基因;另一类为甲状腺特异基因:Tg和TSHR基因。但是这些基因目前都存在着争议,这可能与所研究的对象种族不同,遗传背景存在差异有关。
2000年本课题组的金迎老师收集了辽宁省10个市县54个GD多发家系,共有成员322人。本课题组金迎等通过全基因组扫描的手段将GD的一个主要易感基因定位于染色体5q31区(D5S436-D5S434)。2005年,本课题组的于扬等筛查了5q31区可能与GD发病相关的IL4、IL5、IL13、IL12B、IRF1、UGRP1等14个候选基因所有编码区和至少1,000bp的启动子区中的SNPs,结果未发现这些基因中的SNPs与GD的发病具有相关性,但IRF1基因6447T/G位点基因型为TT的GD患者的发病年龄要显著早于基因型为TG和GG的GD患者。
2008年,本课题组的李佳又在辽宁省新收集了26个GD多发家系,在于扬建立的5q31区单倍型的基础上利用共有的80个家系,在5q31区域对GD易感基因进行进一步的研究,得到:JAKMIP2基因可能是中国人Graves病的易感基因。
近年来,人们对GD遗传的研究更倾向于认为不存在真正的主要致病基因,而是由多个基因共同作用,同时,又有学者认为:可能存在人类自身免疫病的共有基因。在最近的两年中,SLC22A4基因受到研究者们的关注。除自身免疫性甲状腺疾病外,其他自身免疫性疾病与这一基因的相关性,已有研究者进行关注。并且这一基因定位在5q31区域,正是本研究组金迎所得得到的GD易感区域,并且,5q31-33区为自身免疫性疾病的易感区域。另外,最近对于GD易感基因的研究,CTLA-4基因再次受到关注。因此,下一步,在扩大样本的基础上,这两个基因也是我们要研究的重点。
对象与方法：
对本研究组收集的80个GD多发家系(478名成员)进行外周血基因组DNA的提取,利用Taqman方法对热点基因进行SNP分型研究:
1.rs3792876位于SLC22A4基因的第一内含子中,与转录因子RUNX1结合,可调节SLC22A4基因的转录。
2.CTLA-4是T淋巴细胞活化的重要负调节分子,大量的遗传学及免疫学研究证实CTLA-4基因与GD的发病相关。Rs3087243位于CTLA-4的3UTR,这一位点可使CTLA-4的表达水平改变,影响对T细胞的抑制作用。
哈迪温伯格平衡检测利用x2检验的方法,GD患者与正常对照间的基因型频率及等位基因频率相比较用x2检验,利用Family-basedAssociatedTests(FBAT)软件进行基于家系的遗传统计分析。
结果：
1、将家系人群分为病例组(GD患者)及对照组(一级亲属),两个位点的等位基因和基因型在病例和对照组中呈现相似的分布,其频率差异并没达到统计学显著水平(p＞0.05)。
2、运用家系为基础的相关性检验FBAT方法,来研究候选基因与GD发病的相关性,两个位点均与GD家系中GD的发病无关(SLC22A4基因p=0.813,CTLA4基因p=0.109)。
3、将选择药物治疗的70例GD患者(参加随访调查的GD患者)分为复发组与无复发组。我们未发现两组之间基因型分布具有明显的统计学差异(p＞0.05)。
4、将随访到的一级亲属分为甲状腺功能正常组与甲状腺功能异常组进行比较,并未发现两组之间基因型分布具有明显的统计学差异(p＞0.05)。
5、SLC22A4基因研究中,T等位基因的基因型(CT+TT)的一级亲属患病年龄要明显晚于只含有C等位基因的CC基因型的患者(p=0.005).
结论：
1、SLC22A4基因和CTLA4基因与中国汉族Graves病发病无关联,可能不是其主要的易感基因。
2、SLC22A4基因和CTLA4基因与GD患者药物治疗后转归情况及一级亲属甲状腺功能异常的发病情况无关。
3、SLC22A4基因rs3792876位点含T等位基因的GD患者发病年龄更晚。