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目的:研究人骨形态发生蛋白2和9(human bone morphogenetic protein2 and9，hBMP2 and hBMP9)对人胃腺癌细胞系MNK-45和SGC-7901细胞增殖、凋亡和迁移的影响并初步探讨其作用机制。 方法:以携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和hBMP2或hBMP9基因的重组腺病毒（Ad-hBMP2或Ad-hBMP9）分别感染人胃腺癌MNK-45和SGC-7901细胞，以只携带GFP基因的重组腺病毒(Ad-GFP)感染的细胞为实验对照组，再设不加任何处理因素的空白组，整个实验分以下四个部分进行; 第一部分、重组腺病毒的扩增及其所携带的目的基因hBMP2和hBMP9在人胃腺癌细胞中的表达检测。以人胚肾细胞(HEK293)为腺病毒的包装细胞，大量制备高质量的Ad-hBMP2、Ad-hBMP9和Ad-GFP;分别用RT-PCR和免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）检测在被Ad-hBMP2和Ad-hBMP9感染后的MNK-45和SGC-7901细胞中的hB MP2和hBMP9的mRNA水平及蛋白水平; 第二部分、体外实验检测Ad-hBMP2和Ad-hBMP9的感染对人胃癌细胞MNK-45和SGC-7901的增殖、凋亡和迁移的影响。MTT法检测细胞增殖，Hoechst33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡，划痕愈合试验和Trans-well小室检测细胞迁移能力; 第三部分、hBMP2 and hBMP9对人胃腺癌细胞系MNK-45和SGC-7901中Smad1/5/8、GSK-3β和β-catenin的影响，为阐明hBMP2 and hBMP9对人胃腺癌细胞的作用机制奠定基础。采用Western blotting法:1）检测BMP/Smad信号通路的重要信号分子Smad1/5/8的水平及其磷酸化水平(p-Smad1/5/8);2)检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子的水平，包括GSK-3β和磷酸化的GSK-3β(T-GSK-3β和pser9-GSK-3β)及β-catenin的水平; 第四部分、体内实验验证体外实验结果。用Ad-hBMP2、Ad-hBMP9和Ad-GFP分别感染SGC-7901细胞，24h后细胞融合度约为90％，病毒感染率达40％-50％，常规消化收集细胞，用PBS制成1.0×108个/ml的细胞悬液，每只裸鼠皮下接种0.1ml，观察各组肿瘤生长情况，绘制肿瘤的生长曲线;48天时处死裸鼠进一步测量皮下瘤的体积和重量，再对形成的皮下瘤进行石蜡包埋、切片检测。包括:HE染色观察瘤组织的病理学特征，免疫组织化学染色（Immunochemical staining，IHC）检测皮下瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)和血管内皮生长因子(VEGF)及信号通路中的重要分子p-smad1/5/8、T-GSK-3β和p-GSK-3β和β-catenin的水平。 结果: 1、HEK293细胞分别被Ad-hBMP2和Ad-hBMP9及其对照腺病毒Ad-GFP感染后，均有绿色荧光蛋白表达，72h后的感染率均在95％以上;收集细胞于小量的PBS中，反复冻融至少3次，再用其上清感染HEK293细胞;反复3-4轮扩增，最终获得高滴度的重组腺病毒液，分装后冻存于-20℃备用。 2、MNK-45和SGC-7901中hBMP2和hBMP9的内源性表达极低，无论mRNA还是蛋白质水平，尤其SGC-7901; 3、扩增的重组腺病毒Ad-hBMP2和Ad-hBMP9的干预（感染）能够有效地上调靶细胞中的hBMP2和hBMP9的mRNA和蛋白质的水平，即干预有效。 1) RT-PCR检测发现:MNK-45和SGC-7901细胞被Ad-hBMP2和Ad-hBMP9感染后， hBMP2和hBMP9 mRNA表达明显增高(P＜0.01); 2)ICC的结果与RT-PCR一致:即MNK-45和SGC-7901细胞中hBMP2和hBMP9蛋白质的本底表达均较低，而感染后则明显增高:MNK-45细胞中hBMP2和hBMP9分别是实验对照组(GFP组)的1.89倍和1.67倍(P＜0.01); SGC-7901细胞中的hBMP2和hBMP9分别是GFP组的1.52倍和1.37倍(P＜0.01)。 4、 hBMP2和hBMP9抑制MNK-45和SGC-7901细胞的增殖: MTT结果显示:Ad-hBMP2和Ad-hBMP9感染MNK-45和SGC-7901细胞后，从第3天始细胞的增殖即被抑制。 1) hBMP2+MNK-45细胞组:在第3、4和5天的活细胞数分别较GFP组降低29.45±1.07％(P＜0.05)、34.39±2.07％(P＜0.01)和49.15±1.57％(P＜0.001); 2) hBMP9+MNK-45细胞组:第3、4和5d的活细胞数分别较GFP组降低30.45±2.01％(P＜0.05)、36.20±2.09％(P＜0.01)和56.13±1.89％(P＜0.001); 3) hBMP2+SGC-7901细胞组:第3、4和5d的活细胞数分别较GFP组降低31.35±2.13％(P＜0.05)、33.27±1.78％(P＜0.01)和47.17±1.89％(P＜0.001); 4) hBMP9+SGC-7901细胞组:第3、4和5d的活细胞数分别较GFP组降低30.20±1.76％(P＜0.05)、36.20±1.69％(P＜0.01)和56.13±1.86％(P＜0.001)。 5、hBMP2和hBMP9促进MNK-45和SGC-7901细胞的凋亡。 1)重组腺病毒干预48h后Hoechst33258染色发现: ①MNK-45细胞的hBMP2组和hBMP9组的凋亡率分别是GFP组的6.03±0.89倍(P＜0.01)和8.89±1.12倍(P＜0.001); ②SGC-7901细胞的hBMP2组和hBMP9组的细胞凋亡率分别是GFP组的6.74±0.78倍(P＜0.01)和7.16±1.51倍(P＜0.01)。 2)重组腺病毒干预72h后流式细胞术检测发现: ①MNK-45细胞的hBMP2组的早期凋亡细胞数是GFP组的3.39倍(P＜0.001)，晚期凋亡细胞数是GFP组的2.97倍(P＜0.01);其hBMP9组的早期凋亡细胞数是GFP组的1.35倍(P＜0.05)，晚期凋亡细胞数是GFP组7.33倍(P＜0.001); ②SGC-7901细胞的hBMP2组的早期凋亡细胞数是GFP组的4.43倍(P＜0.001)，晚期凋亡细胞数是GFP组的2.23倍(P＜0.05);其hBMP9组早期凋亡细胞数是GFP组的5.58倍(P＜0.001)，晚期凋亡细胞数是GFP组的4.71倍(P＜0.001)。 即Hoechst33258染色法与FCM一致地提示hBMP2和hBMP9能够促进MNK-45和SGC-7901细胞的凋亡。 6、hBMP2和hBMP9抑制MNK-45和SGC-7901细胞的迁移。 重组腺病毒干预72h时: 1) MNK-45细胞+hBMP2组:划痕愈合率和迁移细胞数分别是GFP组47.01％(P＜0.01)和36.84±2.89％(P＜0.01); 2) MNK-45细胞+hBMP9组:划痕愈合率和迁移细胞数分别是GFP组50.45％(P＜0.01)和38.12±3.41％(P＜0.01); 3) SGC-7901细胞+hBMP2组:划痕愈合率和迁移细胞数为分别是GFP组52.18％(P＜0.01)和32.45±3.41％(P＜0.01); 4)SGC-7901细胞+hBMP9组:划痕愈合率和迁移细胞数为分别是GFP组54.05％(P＜0.01)和36.13±2.78％(P＜0.01)。 即划痕愈合试验与Trans-well小室检测结果一致提示hBMP2和hBMP9可抑制MNK-45和SGC-7901细胞的迁移。 7、 hBMP2和hBMP9上调MNK-45和SGC-7901细胞中Smad1/5/8的磷酸化水平，但对Smad1/5/8水平无明显影响。 Western blotting检测发现: 1) MNK-45细胞:hBMP2组和hBMP9组的p-smad1/5/8分别较GFP组高2.14±0.45倍(P＜0.01)和2.24±0.32倍(P＜0.01); 2) SGC-7901细胞:hBMP2组和hBMP9组的p-smad1/5/8分别较GFP组高3.89±0.68倍(P＜0.001)和4.17±0.83倍(P＜0.001); 3)hBMP2和hBMP9作用后对MNK-45和SGC-7901细胞的T-Smad1/5/8表达量无明显变化(P＞0.05)。 8、hBMP2和hBMP9上调MNK-45和SGC-7901细胞中GSK-3β的磷酸化水平，但对总的GSK-3β和β-catenin的表达量无明显影响。 Western blotting检测发现: 1) MNK-45细胞:hBMP2组和hBMP9组的pser9-GSK-3β的表达量分别是GFP组的1.94±0.34倍(P＜0.01)和2.17±0.51倍(P＜0.01); 2) SGC-7901细胞:hBMP2组和hBMP9组的pser9-GSK-3β的表达量分别是GFP的2.34±0.45倍(P＜0.01)和3.17±0.57倍(P＜0.01); 3)各组细胞的总的GSK-3β和β-catenin表达量均无明显差异(P＞0.05)。 9、hBMP2和hBMP9抑制SGC-7901细胞在裸鼠皮下移植瘤的生长 1)四组的成瘤率均为100％(4/4); 2)随接种时间的延长，四个组的肿瘤体积均逐渐增大，以hBMP9组的瘤体增长最缓慢，自24d起该组肿瘤体积明显小于其它三组(P＜0.05); 3)48天时处死裸鼠，取出瘤体，并量体积和称重:空白组与GFP组的体积和重量无明显差异;hBMP2组的皮下瘤体积与GFP组也无明显差异，但瘤体的重量则降低30.21±4.31％(P＜0.05);hBMP9组的皮下瘤体积和重量则分别较GFP组降低83.34±5.78％(P＜0.001)和67.53±7.89％(P＜0.01); 4) HE染色后发现:在空白组和GFP组可见大量低分化腺癌细胞，与体外培养的胃癌SGC-7901极为类似，细胞形态不规则，失去极性，细胞核较大，核浆比例失调。而在hBMP2+SGC-7901组:可见这种低分化腺癌出现大片凝固性坏死，胞体明显肿胀，胞浆透明化，部分细胞核溶解、消失。hBMP9+SGC-7901组:依然为低分化腺癌细胞，在瘤体内部呈多灶、团块状坏死;大量细胞核缺如，部分细胞染色质凝固。 5) hBMP2和hBMP9降低皮下瘤组织中的PCNA和VEGF的表达量。IHC染色发现:hBMP2和hBMP9组中PCNA的阳性细胞数分别较GFP组降低69.33±0.49％(P＜0.01)和87.94±0.56％(P＜0.001);其VEGF的阳性细胞数分别较GFP组降低的92.32±0.78％(P＜0.001)和95.17±0.67％(P＜0.001); 6)hBMP2和hBMP9增加皮下瘤组织中P-Smad1/5/8和Pser9-GSK-3β的表达量。IHC染色发现:hBMP2和hBMP9组中P-Smad1/5/8表达量分别较GFP组高0.89±0.26倍(P＜0.05)和9.03±0.15倍(P＜0.001)，而Pser9-GSK-3β的表达量分别是GFP组的5.41±0.78倍(P＜0.01)和1.74±0.63倍(P＜0.05)。 其中，hBMP9组中P-Smad1/5/8是hBMP2组的10.14±0.37倍(P＜0.01)，而hBMP2组中pser9-GSK-3β的表达量又是hBMP9组的3.11±0.89倍(P＜0.01)。 7)hBMP2和hBMP9对皮下瘤中总的GSK-3β和β-catenin的水平无明显影响(P＞0.05)，与体外实验结果一致。 结论: 1) hBMP2和hBMP9在胃癌MNK-45和SGC-7901细胞中的本底表达低;自制的Ad-hBMP2和Ad-hBMP9携带的目的基因能在这两株细胞中成功表达，即成功上调hBMP2和hBMP9的水平; 2)体内和体外实验一致地揭示hBMP2和hBMP9对胃癌细胞系MNK-45和SGC-7901具有抑制性作用，包括抑制细胞增殖和迁移、促进凋亡、抑制其皮下移植瘤的生长、下调其PCNA和VEGF的水平等;其促凋亡和下调PCNA和VEGF可能是其抑制胃癌增殖及生长的一部分机制。提示hBMP2和hBMP9在胃癌治疗中可能具有潜在的应用价值; 3)体内、体外实验一致地揭示hBMP2和hBMP9可以增加MNK-45和SGC-7901细胞中及其皮下移植瘤组织中p-Smad1/5/8和Pser9-GSK-3β水平。这可能够是hBMP2和hBMP9对胃腺癌MNK-45和SGC-7901细胞的抑制性作用的部分机制，尚待验证; 4)比较分析hBMP2与hBMP9的作用发现:(1)对于抑制皮下瘤生长及其血管的生成和促进Smad1/5/8的磷酸化，hBMP9的活性强于hBMP2;(2)对于促进GSK-3β的磷酸化，hBMP2的活性又强于hBMP9。可能它们对于Smad1/5/8和GSK-3β的磷酸化活性的差异导致了它们对胃癌的抑制活性的差异。 5)本工作为明确BMP家族成员在肿瘤（尤其胃癌）发生发展中的作用及可能机制积累了实验依据，为胃癌的防治提供了新的线索。