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肝炎是现代社会威胁人类生命健康的主要疾病之一,其治疗主要采用核苷类药物和干扰素,药物在病变部位浓度较低。树枝状聚合物是近些年国际上兴起的具有多功能团的球状聚合物,其表面的功能团(羧基、氨基和羟基)除了可以和药物相连外,还可以与具有特异靶向作用的配基偶联。将树枝状聚合物用具有肝靶向的半乳糖胺修饰之后,再和干扰素偶联,即得肝靶向的共轭物,以解决干扰素在肝脏分布较少的问题,改善治疗效果。偶联的聚合物同时还可以保护干扰素免受蛋白酶的破坏,降低或消除免疫原性。通过选择高分子量的聚合物或者控制聚合物与干扰素的多价偶联,还能够提高偶联物的整体大小,降低肾小球过滤,延长干扰素的血浆半衰期,从而同时达到长效的目的。
本实验主要针对第3.5代PAMAM树枝状聚合物与半乳糖胺的偶联和产物的纯化及表征方面进行了研究,还尝试了将干扰素与PAMAM树枝状聚合物进行了偶联,以为半乳糖胺-树枝状聚合物-干扰素三联偶联物的制备打下基础。
在PAMAM与半乳糖胺的偶联中,通过对比在水相和有机相(无水DMSO)中的偶联反应产物的TLC图谱和电泳图谱,结合GPC的结果,发现了在无水DMSO中偶联效率较高,该反应条件暂定为：聚合物-氨基半乳糖-DCC-NHS偶联剂(1:20:65:65),在安瓿瓶中以无水DMSO作溶剂,先将羧基活化20min,立即加入氨基半乳糖反应20h。
偶联产物的鉴别是本研究的一个难点。由于树枝状聚合物的特殊性质,聚合物及其偶联产物在各种薄层层析板(无论正相还是反相)上均无法展开；利用核磁共振和质谱也难以对是否偶联上以及偶联上多少半乳糖胺等做出准确的判断。只能借助于反应产物在反应液中几乎没有残留等来间接推理出偶联成功。在尝试了各种不同的凝胶电泳方法之后,最终筛选出Tricine-SDS-PAGE的方法,控制电泳条件,终于在电泳图谱上看到了偶联产物出现在与树枝状聚合物不同位置的条带上。综合运用各种证据,如在NMR-1H法中通过对比PAMAM、2-氨基乙基β-D-吡喃半乳糖苷及其偶联物PAMAM-D-氨基半乳糖的NMR-1H图谱,可以确定偶联物中有半乳糖基；TLC检识发现反应液中几乎没有半乳糖胺反应物的残留；结合Tricine-SDS-PAGE,最终证实了半乳糖胺与PAMAM的成功偶联。对于控制反应条件如半乳糖胺的投料量来实现可控偶联(控制偶联上的半乳糖胺的数目)的工作正在进行之中。偶联物的纯化是本研究的另一个难点,先后尝试了制备薄层、硅胶微柱、氯仿/水萃取法、膜过滤法、亲水透析法(国产透析带)、亲脂透析法(进口透析带)、凝胶渗透色谱法(GPC)等。但由于树枝状聚合物及其偶联产物的特殊性质,无论使用何种溶剂,都无法将两者从制备薄层和硅胶柱上洗脱下来(即便以甲醇将上样带取出提取)。氯仿/水萃取法和膜过滤法由于产物损失较大而不适用,国产透析带也由于孔径不均匀致使产物大量损失。最后筛选用进口透析带将产物对甲醇透析24h以除掉大部分的DMSO和小分子杂质,然后再用GPC法用Sephadex LH-20凝胶柱进行精制(以甲醇洗脱,收集先出柱的第一个峰)的方法,使偶联产物得到了很好的纯化。本研究还将PAMAM与干扰素进行了偶联,初步确定了各个步骤的实验方法：并用透析法进行纯化,用Tricine-SDS-PAGE对产物进行了鉴别。后续工作仍在进行中。
本研究以理论为指导,采用现代技术和方法建立了PAMAM与肝靶向配基半乳糖胺的偶联以及偶联产物的纯化和表征的方法。以树枝状聚合物为载体制备肝靶向长效干扰素的设计,是一个通用性很强的平台,稍加修饰即可用于其它种类众多的药物(比如抗肿瘤药物),具有广阔的应用用前景。