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多年前,人们发现酶在有机溶剂中不但具有较高的催化活性,而且表现出不同的立体选择性和热稳定性,并发现酶在有机溶剂中比在水溶液中具有潜在的优势。本实验研究了15种不同疏水参数(logP)、不同浓度的有机溶剂在单相共溶剂体系或水-有机两相体系中对木瓜蛋白酶(papain,PA)活性的影响;探讨有机溶剂对PA的作用机制,为在有机溶剂中对PA的应用提供理论依据;同时也对PA在水-有机两相体系中酶法合成胸腺五肽(Thymopoietin,TP)进行了详细的研究。
研究发现二甲基亚砜、1,4-二氧六环、乙腈在低浓度时,PA的活性比缓冲液中的有所升高。随着甲醇浓度的逐渐提高,PA的活性逐渐降低。乙醇、丙醇在低浓度时,PA的活性与缓冲液中的基本相当,随着乙醇、丙醇浓度的进一步提高,PA的活性逐渐降低。随着四氢呋喃、正丁醇、戊醇浓度逐渐升高,酶活性从一开始下降就很快。乙酸乙酯、己醇在低浓度时,酶活性降低较快,但浓度分别超过25％和20%时,酶活性开始升高,但仍低于缓冲液中的酶活性。苯、甲苯、正己烷、十二醇的情况与乙酸乙酯、己醇相似,不同的是随着logP的升高,有机溶剂对PA活性的影响逐渐降低;在低浓度时,酶活性下降较慢,超过一定浓度时,酶活性开始升高,并高于缓冲液中的酶活性。
酶法合成胸腺五肽的反应体系以乙酸乙酯作为有机介质,在水-有机两相体系中以Boc-Val和Tyr-OMe为底物,用PA催化合成Boc-Val-Tyr-OMe时,首先对反应系统的pH值、离子浓度、酶量、时间和温度等条件分别进行单因素测定,然后根据试验结果确定正交实验的各单因素水平,最后经正交试验证明:最佳反应条件为pH值6.0、离子浓度0.2 mol/L、酶量8 mg、时间48 h、温度40℃,产率达63.7%。其中,酶量对Boc-Val-Tyr-OMe二肽的合成影响最大;反应时间对Boc-Val-Tyr-OMe二肽的合成影响最小。
反应体系以乙酸乙酯作为有机介质,在水-有机两相体系中以Boc-Arg(pbf)和Lys-OMe为底物,用PA催化合成Boc-Arg(pbf)-Lys-OMe时,首先对反应系统的pH值、离子浓度、酶量、时间和温度等条件分别进行单因素测定,然后根据试验结果确定正交实验的各单因素水平,最后经正交试验证明:最佳反应条件为pH值7.0、离子浓度0.8 mol/L、酶量4 mg、时间72 h、温度50℃,产率达66.93%。其中,温度对Boc-Arg(pbf)-Lys-OMe二肽的合成影响最大;pH值对Boc-Arg(pbf)-Lys-OMe二肽的合成影响最小。
使用真空冷冻干燥机对合成Boc-Arg(pbf)-Lys-OMe后所得产物进行冷冻干燥,得到白色粉末状物质,加入到饱和NH4Cl中,20 min后,加入乙酸乙酯萃取四次;乙酸乙酯层分别用饱和NH4Cl、ddH2O、饱和NaCl洗涤,再使用MgSO4干燥;过滤,减压浓缩得黄色油状产品。经液相色谱-质谱分析检验,二肽的纯化度提升一倍多,效果明显。
反应体系以乙酸乙酯作为有机介质,在水-有机两相体系中以Boc-Arg(pbf)-Lys和Asp-OMe为底物,用PA催化合成Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe,产率为26.9%。
反应体系以乙酸乙酯作为有机介质,在水-有机两相体系中以Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp和Val-Tyr-OMe为底物,用PA催化合成Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-Val-Tyr-OMe,之后去除多余基团得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr,产率为17.8%。