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生育酚是一类仅能在植物、藻类等光合生物体内合成，为人体和动物所必需的维生素E重要组分。作为一种重要的脂溶性抗氧化剂，生育酚的抗氧化功能已经在体外模型和动物体内得以证实，但其在植物体内的具体功能还不是完全清楚。近年来研究显示，生育酚还具有抗氧化作用以外的其他更为重要功能。为了进一步研究植物体内生育酚的生理功能，我们选择水稻为材料，利用RNA干扰获取叶片生育酚合成抑制甚至缺失的突变体，为全面认识生育酚的功能奠定基础。本研究构建了水稻生育酚环化酶基因RNA干扰表达载体，并通过农杆菌介导转化水稻成熟胚来源的愈伤组织。经过组织培养再生，获得抗性再生植株。利用HPLC方法测定叶片中生育酚的含量，并对生育酚合成抑制程度不同的植株进行表型和生理特性分析。主要研究内容及结果如下：
⑴生育酚环化酶基因RNA干扰表达载体的构建：提取水稻总RNA，以特异性引物RT-PCR，扩增得到500 bp大小的基因干扰片段。通过设计的两组双酶切，分别正向、反向连入中间载体pSTARLING质粒的cre内含子两侧，构建RNA干扰表达盒。通过Not I酶切，将该表达盒插入到植物双元表达载体pWbvec8的Not I位点上，成功构建了RNA干扰表达载体。
⑵农杆菌介导的水稻遗传转化：冻融法将表达载体质粒转化进入农杆菌LBA4404中，用于侵染由水稻成熟胚来源的愈伤组织。确定较为合适的侵染条件为：农杆菌菌液浓度OD600为0.5，侵染时间20 min。经过3 d共培养后，进行两轮的潮霉素抗性筛选，共获得抗性再生愈伤组织块93个，抗性再生率为18.1％。后经预分化和分化培养，共获得抗性植株78株，移栽温室土壤培养成活57株。
⑶抗性植株生育酚含量测定及表型、生理特征分析：利用HPLC方法分析57株抗性植株叶片生育酚的含量，证实全部再生植株均为阳性。与野生型植株叶片生育酚含量相比，抗性植株体内含量在0.1％～75％。其中生育酚合成抑制程度较高，含量仅为野生型5％以下的植株有30株，约占总体的52.6％。对RNA干扰植株的株高，光合速率，光合色素等生理指标进行了测定，结果发现生育酚缺乏导致了植株生长明显延缓和光合速率下降，但对光合色素的含量及组成影响不大。