论文部分内容阅读
细菌的耐药性通过其耐药基因(antimicrobial resistance genes,ARGs)在不同菌群间广泛传播,严重威胁人类健康,而畜禽养殖业作为耐药性传播源之一,对其进行深入研究具有重要的实际意义。有研究报道,畜禽摄入的抗生素30%-90%会以原形形式通过粪便排出体外,最后以不同方式进入环境土壤和河流。同时,粪便中残留的抗生素及耐药菌可能影响土壤植物和蔬菜,而植物根系作为微生物基因交流的重要位点,ARGs可能通过植物内生菌进入蔬菜内,通过食物链被人类食用,对人类健康构成潜在威胁(特别是一些可生食的蔬菜,如生菜等)。因此,针对这种ARGs从蔬菜传播至人体的特殊传播途径,研究其传播的可行性及其迁移规律意义重大。本文通过添加不同剂量的恩诺沙星(低剂量组(200μg/kg)、中剂量组(2000μg/kg)和高剂量组(20000μg/kg))及无抗粪便至土壤后进行生菜种植,构造粪便-土壤-蔬菜盆栽模型,模拟在恩诺沙星压力下ARGs进入生菜的可能性及其迁移规律研究,模拟实验为期60天。分别在第1天、第30天、第60天采集相应的蔬菜叶茎、根须、土壤样品,液相色谱方法立即测定抗生素残留浓度,确定药物的添加剂量及其在土壤中的降解情况,再分离植物内生菌,提取菌群宏基因组,实时荧光定量PCR等检测ARGs的丰度含量,并定量研究耐药基因的丰度和耐药菌的转移情况,最后评估在粪便中残留抗生素的压力下,ARGs是否能够通过植物根系进入植物及其在土壤-蔬菜不同部位的迁移规律。液相色谱测定结果显示,粪便和土壤中恩诺沙星的残留量均未检测到,而不同剂量抗生素添加后的混合模型在第一天采样后通过检测均达到预定的胁迫浓度标准,满足实验要求。由于植物叶、茎和根表面携带大量非内生菌群,为获得更真实内生菌信息,本文对其表面灭菌消毒最佳方案进行摸索。结果显示,生菜叶茎选用75%乙醇溶液60s浸泡+2%次氯酸钠溶液浸泡120s和根选用75%乙醇溶液浸泡60s+5%次氯酸钠溶液浸泡120s方法处理效果最好,能最大限度的杀灭表面细菌和保护内生菌。对植物叶、茎和根中内生菌的分离培养结果显示,土壤细菌的耐药菌数量与剂量成正相关,且可通过植物内生化作用提高蔬菜耐药内生菌的数量。对土壤细菌和植物内生菌宏基因组的质粒介导喹诺酮耐药基因(plasmid-mediated quinolone resistance genes,PMQR)进行荧光定量PCR,本文选用常见的七种PMQR(qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、qepA、aac(6’)-Ib和oqx B)作为研究,结果显示,样品中qnrS、aac(6’)-Ib、oqx B和qepA检出率较高,土壤样品中PMQR的总丰度(∑ARG)显著高于蔬菜组织叶茎和根(P≤0.05),鸡粪处理组显著高于猪粪处理组(P≤0.05)。植物叶、茎和根中,所有基因中qnrS基因丰度最高,蔬菜样品中耐药率显著高于土壤样品,但是相比于土壤中耐药基因的丰度,数量差约为10~3-10~6,表明在抗生素和粪便压力下,通过植物内生化作用传递耐药基因的可能性很小。低、中剂量试验组的耐药率、相对总丰度(∑ARG)高于高剂量组,即低、中浓度的胁迫更容易导致耐药性产生。总体来说,在恩诺沙星和粪便胁迫下,蔬菜-土壤系统虽会诱导细菌耐药性的产生,但在60天的实验过程中,蔬菜组织中的耐药基因的丰度较低,耐药菌与耐药基因通过植物内生化作用进入蔬菜组织中的可能性依旧很微小。另外,在本次试验中,药物的添加是一次性无多次添加,而在实际生产生活中,通常施肥是两周一次,使药物在土壤会保持长时间的胁迫压力,可能会造成耐药菌、耐药基因的富集,对人类健康造成威胁。