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作为关节炎中最常见的一种类型，骨关节炎(OA)是发生在滑膜关节处的、由于关节软骨的退变导致的免疫相关骨科退行性病变。罹患OA的关节可由感染、氧化和金属蛋白酶的产生量增加判断。滑膜在OA的发展进程中扮演着重要的角色。在OA滑膜观察到的变化包括炎症，增生，肥大，内衬细胞的增加，免疫细胞的浸润。促炎性细胞因子如IL-1β和TNF-α引发了导致OA的进一步发生的炎症反应。在本文中，我们使用IL-1β模仿OA的炎症特征。然后，我们比较鸦胆子苦醇在静态和刺激的细胞中的影响（鸦胆子苦醇是从鸦胆子种植物分离出来的一种苦木苦味素）。首先，我们通过MTS法探究鸦胆子苦醇的细胞毒性作用。然后，我们用MTS和EdU来评估鸦胆子苦醇对OA滑膜细胞增殖的影响。第三，通过流式细胞仪检测鸦胆子苦醇的促凋亡特性。第四，分别用流式细胞术和Griess实验分析ROS和NO产生的量，并进一步对鸦胆子苦醇的抗氧化性能进行评价。鸦胆子苦醇对HO-1基因和蛋白表达的影响分别通过定量PCR和Western blot评估。第五，用免疫印迹和酶谱分析评估MMP-2，MMP-3，MMP-9和MMP-14的产生。第六，评价了鸦胆子苦醇对促炎性细胞因子IL-1β基因和蛋白表达的影响。最后，利用Transwell试验对在OA滑膜细胞的趋化作用中鸦胆子苦醇的作用进行了评估。下面是主要内容和结果:
①骨关节炎滑膜细胞的分离培养
从骨关节炎病患的滑膜组织分离并扩大培养滑膜细胞。将采集到的经活体检查确诊的骨关节炎滑膜样本剪碎，并放置于组织培养瓶中。当滑膜细胞分裂生长至占据培养瓶面积80％左右时将细胞传代培养或液氮冻存以备之后使用。在将此活体组织在体外进行细胞培养7天后，我们可以观察到具纺锤状的细胞存在，此为典型的滑膜细胞形态。分离出的细胞包含滑膜细胞群体，并在此课题中得到使用。我们同时也使用了含多种细胞的群体，用以模拟滑膜的真实细胞环境。
②鸦胆子苦醇对白细胞介素-1β（IL-1β）刺激后的人骨关节炎滑膜细胞在细胞毒性和细胞增殖上的效应
探索鸦胆子苦醇对IL-1β刺激后的人骨关节炎滑膜细胞的细胞毒性效应，选择用于后续研究的鸦胆子苦醇最佳处理浓度，且探索鸦胆子苦醇对IL-1β刺激后的上述细胞在增殖方面的影响。以梯度浓度(10，20，30，40，60，80，100nM)处理细胞24h后，采用MTS试验评估鸦胆子苦醇的细胞毒性效应和IL-1β对人骨关节炎滑膜细胞的刺激效应，后采用EdU试验评估鸦胆子苦醇对IL-1β刺激后的人骨关节炎滑膜细胞的效应。30nM及以下的低浓度鸦胆子苦醇对静息态人骨关节炎滑膜细胞的存活率略有影响但不显著。然而，30nM以上浓度的鸦胆子苦醇处理却对静息态人骨关节炎滑膜细胞的存活率有显著的影响(P＜0.01)。相比于较小的10nM、20nM两个浓度，30nM的鸦胆子苦醇处理在抑制由IL-1β刺激后的人骨关节炎滑膜细胞方面有最明显的效果。EdU试验结果显示，IL-1β能够显著增加人骨关节炎滑膜细胞的增殖，而鸦胆子苦醇能显著地(P＜0.001)抑制IL-1β的促增殖效应。鸦胆子苦醇能够有效地抑制人骨关节炎滑膜细胞由IL-1β诱导之细胞增殖效应，且未表现出明显的细胞毒性。
③鸦胆子苦醇影响人骨关节炎滑膜细胞受刺激所致的细胞凋亡
探索鸦胆子苦醇的抗增殖效应是否与药物所致细胞凋亡相关。将人骨关节炎滑膜细胞分为两组，一组加入5ng/mL的IL-1β，一组不加入IL-1β，两组同时以30nM鸦胆子苦醇处理24h。运用流式细胞术检测人骨关节炎滑膜细胞的凋亡情况。与对照组相比，添加了IL-1β能够抑制人类OA滑膜细胞凋亡的发生。刺激滑膜细胞后，发现鸦胆子苦醇可以诱导人类OA滑膜细胞发生凋亡。然而，进一步发现，在缺少IL-1β刺激的情况下，鸦胆子苦醇仍然可以抑制OA滑膜细胞出现凋亡。在IL-1β刺激后的OA滑膜细胞中，鸦胆子苦醇可以有效地诱导细胞凋亡的发生。
④鸦胆子苦醇对人骨关节炎滑膜细胞HO-1蛋白的表达以及ROS和NO的产生的影响
探索鸦胆子苦醇在氧化应激方面的效应，且评估其对人骨关节炎滑膜细胞ROS和NO的产生之影响。最后，探究鸦胆子苦醇对内源抗氧化酶HO-1表达的影响。在对ROS和NO的检测试验中，将人骨关节炎滑膜细胞分为经5ng/mL的IL-1β刺激和未经刺激两组，并同时用30nM鸦胆子苦醇处理24h。使用DCFH2染色并行流式细胞术检测胞内ROS水平，NO浓度则通过格里斯法（Griess Assay，即亚硝酸盐含量重氮化反应吸光测定法）测定。在检测抗氧化酶HO-1表达量的试验中，将人骨关节炎滑膜细胞经上述相同方法处理，并用qPCR和western blot试验分别检测HO-1的基因表达量和蛋白表达水平。相比未刺激的人骨关节炎滑膜细胞组，IL-1β的刺激可显著地降低ROS(P＜0.001)和NO(P＜0.01)的产生，IL-1β亦可下调HO-1的表达量，但鸦胆子苦醇却表现出对ROS产生调控的双向作用。在静息态细胞中，其可显著下调(P＜0.001) ROS的产生，相比之下，在IL-1β刺激的细胞中鸦胆子苦醇可诱导ROS的产生(P＜0.001)，但诱导产生的ROS水平仍低于对照组。鸦胆子苦醇对静息态和IL-1β刺激的人骨关节炎滑膜细胞中NO的产生均有显著的抑制效应(P＜0.001)。另外，不论IL-1β刺激与否，qPCR和westernblot试验结果都证明鸦胆子苦醇可显著上调人骨关节炎滑膜细胞中HO-1的表达。鸦胆子苦醇具有抗氧化作用。IL-1β可通过下调ROS和NO的产生来降低人骨关节炎滑膜细胞的氧化应激，然而却可通过下调HO-1的表达来提高其对氧化应激的感受性。相应地，鸦胆子苦醇则通过下调ROS和NO的产生并同时上调内源抗氧化酶HO-1的表达表现出它的抗氧化特性。
⑤鸦胆子苦醇对MMPs表达及活性的影响
探究鸦胆子苦醇对MMP-3及MMP-14蛋白表达量的影响，并探究其对MMP-2和MMP-9活性的影响。将人骨关节炎滑膜细胞以静息态及受外源IL-1β刺激分为两组，各施以30nM鸦胆子苦醇处理24h。随后分离其内源蛋白和分泌蛋白并行酶谱及western blot试验。我们用Western blot和qPCR方法检测MMP-3和MMP-14的表达情况，同时用酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性。IL-1β能够显著地上调MMP-3(P＜0.01)和MMP-14(P＜0.05)的表达水平。鸦胆子苦醇的作用和IL-1β的作用相拮抗，表现在鸦胆子苦醇能够明显下调MMP-3(P＜0.01)和MMP-14(P＜0.05)的表达水平。另外，在未经刺激的细胞中，鸦胆子苦醇对MMP-14还存在不显著的影响。同样，IL-1β对MMP-2的产生也存在不显著的影响。然而，不论在有无IL-1β刺激的情况下，鸦胆子苦醇都能够显著下调人骨关节炎滑膜细胞中MMP-2的表达(P＜0.05)。与之相反，IL-1β能够显著上调MMP-9蛋白的表达(P＜0.01)。鸦胆子苦醇不仅使未经刺激的人骨关节炎滑膜细胞中MMP-9的表达量降低(P＜0.01)，而且还能显著地抵消IL-1β导致的MMP-9的表达(P＜0.01)。通过抑制MMPs的表达以及活性，鸦胆子苦醇表现出了某种程度上的抗分解代谢的作用。IL-1β略微对MMP-2的表达有影响，但却能显著诱导MMP-9的表达。鸦胆子苦醇能够高效地抑制MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-14的表达。
⑥鸦胆子苦醇对IL-1β基因和蛋白表达的影响
促炎性细胞因子IL-1β在OA的发病和发展过程中参与了多条分解代谢通路。IL-1β在诱导超常增生、感染、氧化、MMPs的产生及滑膜细胞侵袭的过程中发挥重要作用。因此，我们在这个试验中评估了鸦胆子苦醇对IL-1β基因及蛋白表达的影响。我们先以30nM鸦胆子苦醇加5ng/mL IL-1β和不加IL-1β设计两个处理组培养人OA滑膜细胞24h，后分别用qPCR和western blot法来检测IL-1β的基因和蛋白表达量。从结果上看，外源施加IL-1β组比不施加的组，其内源IL-1β表达量显著上升。然而，鸦胆子苦醇却与外源IL-1β表现出相反的反应，具体体现在它能显著地下调IL-1β的表达量。这部分结果中鸦胆子苦醇表现出的抗炎特性使得它可能成为OA干预中的一种有潜力的治疗手段。
⑦鸦胆子苦醇对IL-1β刺激的人骨关节炎滑膜细胞的趋化作用的影响
伴随着OA中滑膜细胞的侵袭，其增生和MMP的过度产生都是常见的现象。促炎性细胞因子有时也通过诱导趋化因子的产生从而增加OA滑膜细胞的迁移。而OA滑膜细胞向软骨中的迁移可通过血管翳样的物质的产生加速OA的病程。所以我们在此部分探究了鸦胆子苦醇在OA滑膜细胞的趋化性上的影响。在这一部分，我们利用了Transwell系统在实现趋化性评估，首先我们将OA滑膜细胞以无血清培养基培养在Transwell的上层空间，混合有30nM鸦胆子苦醇并添加或不添加IL-1β的培养基家在上述系统的下部，培养24h。然后我们固定迁移的细胞并行结晶紫染色并计数。结果显示，鸦胆子苦醇显著地抑制了OA滑膜细胞的迁移，并进一步提示鸦胆子苦醇能有效抑制静息态及IL-1β刺激的OA滑膜细胞的趋化作用。
骨关节炎是一种多诱因的疾病，并带来重要的经济和社会影响。这篇论文致力于发展一种多用途、纯天然的药物，以期能够为OA的治疗带来有效的干预。这个研究聚焦在OA的四个特征属性上，分别是增生、氧化、MMP产生，以及免疫反应。
①骨关节炎滑膜细胞的分离培养
从骨关节炎病患的滑膜组织分离并扩大培养滑膜细胞。将采集到的经活体检查确诊的骨关节炎滑膜样本剪碎，并放置于组织培养瓶中。当滑膜细胞分裂生长至占据培养瓶面积80％左右时将细胞传代培养或液氮冻存以备之后使用。在将此活体组织在体外进行细胞培养7天后，我们可以观察到具纺锤状的细胞存在，此为典型的滑膜细胞形态。分离出的细胞包含滑膜细胞群体，并在此课题中得到使用。我们同时也使用了含多种细胞的群体，用以模拟滑膜的真实细胞环境。
②鸦胆子苦醇对白细胞介素-1β（IL-1β）刺激后的人骨关节炎滑膜细胞在细胞毒性和细胞增殖上的效应
探索鸦胆子苦醇对IL-1β刺激后的人骨关节炎滑膜细胞的细胞毒性效应，选择用于后续研究的鸦胆子苦醇最佳处理浓度，且探索鸦胆子苦醇对IL-1β刺激后的上述细胞在增殖方面的影响。以梯度浓度(10，20，30，40，60，80，100nM)处理细胞24h后，采用MTS试验评估鸦胆子苦醇的细胞毒性效应和IL-1β对人骨关节炎滑膜细胞的刺激效应，后采用EdU试验评估鸦胆子苦醇对IL-1β刺激后的人骨关节炎滑膜细胞的效应。30nM及以下的低浓度鸦胆子苦醇对静息态人骨关节炎滑膜细胞的存活率略有影响但不显著。然而，30nM以上浓度的鸦胆子苦醇处理却对静息态人骨关节炎滑膜细胞的存活率有显著的影响(P＜0.01)。相比于较小的10nM、20nM两个浓度，30nM的鸦胆子苦醇处理在抑制由IL-1β刺激后的人骨关节炎滑膜细胞方面有最明显的效果。EdU试验结果显示，IL-1β能够显著增加人骨关节炎滑膜细胞的增殖，而鸦胆子苦醇能显著地(P＜0.001)抑制IL-1β的促增殖效应。鸦胆子苦醇能够有效地抑制人骨关节炎滑膜细胞由IL-1β诱导之细胞增殖效应，且未表现出明显的细胞毒性。
③鸦胆子苦醇影响人骨关节炎滑膜细胞受刺激所致的细胞凋亡
探索鸦胆子苦醇的抗增殖效应是否与药物所致细胞凋亡相关。将人骨关节炎滑膜细胞分为两组，一组加入5ng/mL的IL-1β，一组不加入IL-1β，两组同时以30nM鸦胆子苦醇处理24h。运用流式细胞术检测人骨关节炎滑膜细胞的凋亡情况。与对照组相比，添加了IL-1β能够抑制人类OA滑膜细胞凋亡的发生。刺激滑膜细胞后，发现鸦胆子苦醇可以诱导人类OA滑膜细胞发生凋亡。然而，进一步发现，在缺少IL-1β刺激的情况下，鸦胆子苦醇仍然可以抑制OA滑膜细胞出现凋亡。在IL-1β刺激后的OA滑膜细胞中，鸦胆子苦醇可以有效地诱导细胞凋亡的发生。
④鸦胆子苦醇对人骨关节炎滑膜细胞HO-1蛋白的表达以及ROS和NO的产生的影响
探索鸦胆子苦醇在氧化应激方面的效应，且评估其对人骨关节炎滑膜细胞ROS和NO的产生之影响。最后，探究鸦胆子苦醇对内源抗氧化酶HO-1表达的影响。在对ROS和NO的检测试验中，将人骨关节炎滑膜细胞分为经5ng/mL的IL-1β刺激和未经刺激两组，并同时用30nM鸦胆子苦醇处理24h。使用DCFH2染色并行流式细胞术检测胞内ROS水平，NO浓度则通过格里斯法（Griess Assay，即亚硝酸盐含量重氮化反应吸光测定法）测定。在检测抗氧化酶HO-1表达量的试验中，将人骨关节炎滑膜细胞经上述相同方法处理，并用qPCR和western blot试验分别检测HO-1的基因表达量和蛋白表达水平。相比未刺激的人骨关节炎滑膜细胞组，IL-1β的刺激可显著地降低ROS(P＜0.001)和NO(P＜0.01)的产生，IL-1β亦可下调HO-1的表达量，但鸦胆子苦醇却表现出对ROS产生调控的双向作用。在静息态细胞中，其可显著下调(P＜0.001) ROS的产生，相比之下，在IL-1β刺激的细胞中鸦胆子苦醇可诱导ROS的产生(P＜0.001)，但诱导产生的ROS水平仍低于对照组。鸦胆子苦醇对静息态和IL-1β刺激的人骨关节炎滑膜细胞中NO的产生均有显著的抑制效应(P＜0.001)。另外，不论IL-1β刺激与否，qPCR和westernblot试验结果都证明鸦胆子苦醇可显著上调人骨关节炎滑膜细胞中HO-1的表达。鸦胆子苦醇具有抗氧化作用。IL-1β可通过下调ROS和NO的产生来降低人骨关节炎滑膜细胞的氧化应激，然而却可通过下调HO-1的表达来提高其对氧化应激的感受性。相应地，鸦胆子苦醇则通过下调ROS和NO的产生并同时上调内源抗氧化酶HO-1的表达表现出它的抗氧化特性。
⑤鸦胆子苦醇对MMPs表达及活性的影响
探究鸦胆子苦醇对MMP-3及MMP-14蛋白表达量的影响，并探究其对MMP-2和MMP-9活性的影响。将人骨关节炎滑膜细胞以静息态及受外源IL-1β刺激分为两组，各施以30nM鸦胆子苦醇处理24h。随后分离其内源蛋白和分泌蛋白并行酶谱及western blot试验。我们用Western blot和qPCR方法检测MMP-3和MMP-14的表达情况，同时用酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性。IL-1β能够显著地上调MMP-3(P＜0.01)和MMP-14(P＜0.05)的表达水平。鸦胆子苦醇的作用和IL-1β的作用相拮抗，表现在鸦胆子苦醇能够明显下调MMP-3(P＜0.01)和MMP-14(P＜0.05)的表达水平。另外，在未经刺激的细胞中，鸦胆子苦醇对MMP-14还存在不显著的影响。同样，IL-1β对MMP-2的产生也存在不显著的影响。然而，不论在有无IL-1β刺激的情况下，鸦胆子苦醇都能够显著下调人骨关节炎滑膜细胞中MMP-2的表达(P＜0.05)。与之相反，IL-1β能够显著上调MMP-9蛋白的表达(P＜0.01)。鸦胆子苦醇不仅使未经刺激的人骨关节炎滑膜细胞中MMP-9的表达量降低(P＜0.01)，而且还能显著地抵消IL-1β导致的MMP-9的表达(P＜0.01)。通过抑制MMPs的表达以及活性，鸦胆子苦醇表现出了某种程度上的抗分解代谢的作用。IL-1β略微对MMP-2的表达有影响，但却能显著诱导MMP-9的表达。鸦胆子苦醇能够高效地抑制MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-14的表达。
⑥鸦胆子苦醇对IL-1β基因和蛋白表达的影响
促炎性细胞因子IL-1β在OA的发病和发展过程中参与了多条分解代谢通路。IL-1β在诱导超常增生、感染、氧化、MMPs的产生及滑膜细胞侵袭的过程中发挥重要作用。因此，我们在这个试验中评估了鸦胆子苦醇对IL-1β基因及蛋白表达的影响。我们先以30nM鸦胆子苦醇加5ng/mL IL-1β和不加IL-1β设计两个处理组培养人OA滑膜细胞24h，后分别用qPCR和western blot法来检测IL-1β的基因和蛋白表达量。从结果上看，外源施加IL-1β组比不施加的组，其内源IL-1β表达量显著上升。然而，鸦胆子苦醇却与外源IL-1β表现出相反的反应，具体体现在它能显著地下调IL-1β的表达量。这部分结果中鸦胆子苦醇表现出的抗炎特性使得它可能成为OA干预中的一种有潜力的治疗手段。
⑦鸦胆子苦醇对IL-1β刺激的人骨关节炎滑膜细胞的趋化作用的影响
伴随着OA中滑膜细胞的侵袭，其增生和MMP的过度产生都是常见的现象。促炎性细胞因子有时也通过诱导趋化因子的产生从而增加OA滑膜细胞的迁移。而OA滑膜细胞向软骨中的迁移可通过血管翳样的物质的产生加速OA的病程。所以我们在此部分探究了鸦胆子苦醇在OA滑膜细胞的趋化性上的影响。在这一部分，我们利用了Transwell系统在实现趋化性评估，首先我们将OA滑膜细胞以无血清培养基培养在Transwell的上层空间，混合有30nM鸦胆子苦醇并添加或不添加IL-1β的培养基家在上述系统的下部，培养24h。然后我们固定迁移的细胞并行结晶紫染色并计数。结果显示，鸦胆子苦醇显著地抑制了OA滑膜细胞的迁移，并进一步提示鸦胆子苦醇能有效抑制静息态及IL-1β刺激的OA滑膜细胞的趋化作用。
骨关节炎是一种多诱因的疾病，并带来重要的经济和社会影响。这篇论文致力于发展一种多用途、纯天然的药物，以期能够为OA的治疗带来有效的干预。这个研究聚焦在OA的四个特征属性上，分别是增生、氧化、MMP产生，以及免疫反应。