论文部分内容阅读
现今，重金属污染已经成为日趋严重的世界性问题而受到人们的重视。植物对重金属毒害的抗性机理和如何提高植物抵御重金属胁迫能力的研究也越来越引起人们的关注。目前国内关于植物逆境蛋白的研究主要集中在抗旱、抗盐等方面，关于水生植物的重金属胁迫蛋白的研究甚少，也未见过重金属胁迫下水生植物的蛋白质组学方面的研究报道。
本文以分布广泛的水生植物水花生(Alternanthera philoxeroides(Mart.)L.)、槐叶苹(Salvinia natans L.)、菹草(Potamogeton CFISpus L.)为材料，通过模拟水体重金属污染环境，运用生理生化测定、透射电镜、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-MS)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及差异蛋白质组学(双向电泳和质谱技术)等实验手段，较全面系统地研究了重金属(镉、锌、铅)对水生植物体内抗氧化系统、营养元素含量和蛋白质合成动态的影响。
研究结果表明：在重金属的作用下，水生植物体内与逆境密切相关的物质和抗氧化酶发生一系列变化，且表现出明显的剂量/效应关系和时间/效应关系。随着处理浓度的加大、处理时间的延长，可溶性蛋白含量和叶绿素含量均出现下降的趋势，MDA含量和超氧阴离子自由基产生速率则持续升高；在低浓度和短时间胁迫下，水生植物启动了细胞的防御反应，体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等酶活性发生了应激性的提高；抗氧化剂(GSH，AsA等)水平也有相应变化，起到了一定的保护作用。但随着毒害的加重，超过了细胞防御系统的保护限度，部分保护酶活性降低，更多的膜质过氧化产物产生，细胞结构和功能也遭到破坏。差异蛋白质组学研究发现铅、锌胁迫下水花生叶片和根系中一些与重金属胁迫抗性有关的蛋白质的上调表达，这些蛋白可能参与水生植物抵御重金属胁迫的机制也是首次被报道。
(1)研究了生长在不同镉(Cd)处理浓度下菹草叶片的抗氧化酶活性和营养元素含量的变化情况。发现菹草叶片可以大量积累镉离子。Cd胁迫下的菹草叶片中脂质过氧化作用增强，超氧阴离子产生速率升高，而叶片的叶绿素含量显著下降。与对照相比，POD活性在不同浓度镉处理下出现波动变化，而SOD和CAT的活性随着镉胁迫的增强而逐渐升高。这些结果表明，在重金属镉胁迫下，抗氧化酶系统在菹草叶片中起到很重要的保护作用。叶片的营养元素含量与镉处理浓度之间存在着相关性。镉元素胁迫使得叶片中钾、磷和锰元素的含量下降，提高了铜、钙和锌的含量，而铁元素含量变化不大。可溶性蛋白质含量测定和SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果初步显示了镉处理对叶片中蛋白质数目及含量的影响。
(2)对梯度浓度(0-5mM)锌胁迫下水花生叶片的抗氧化系统及锌胁迫蛋白进行了研究。随着锌浓度的升高，叶片中锌的累积量增加，MDA含量和超氧阴离子产生速率升高，而叶绿素含量显著下降。Zn可促进抗氧化酶体系中SOD、POD、CAT、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的上升，也提高了抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)和脯氨酸的水平。因此抗氧酶活性的上升和抗氧化剂含量的增加可以表明Zn诱导了水花生叶片的氧化胁迫，植物也通过抗氧化系统活性的增强来抵御重金属的毒害作用。双向电泳分析结果表明，与对照相比，受Zn胁迫的叶片中诱导了5个蛋白质的上调表达。通过MALDI-TOF质谱鉴定这些上调表达的蛋白分别是：tAPX、抗病基因编码蛋白和信号传导相关蛋白等，在其他报道中发现它们与植物的抗逆性有关。我们认为这些蛋白可能参与了水生植物抵御重金属胁迫的进程。
(3)梯度浓度(0-5mM)铅胁迫对水花生叶片和根系的抗氧化系统的影响及铅胁迫蛋白的研究。结果表明：叶片和根系对铅的吸收量随营养液中铅浓度的提高而增大，且根系对铅的吸收量显著。铅胁迫对营养元素吸收的影响：叶片和根系中P和Mg的含量都下降，Cu和Na的含量都升高。随Pb处理浓度的增高，叶片和根系的MDA含量和O2+产生速率都增加，而叶绿素和可溶性蛋白含量都下降。铅胁迫促进叶片中POD活性的上升，SOD和CAT活性呈现先升后降的趋势；而根系中这三种酶活性都为先升高后降低。双向电泳分析结果表明，铅分别诱导了叶片和根系中3个和6个蛋白质的上调表达。通过MALDI-TOF质谱鉴定这些上调表达的蛋白是类蛋白激酶、成熟酶、营养贮藏蛋白A和核糖体小亚基蛋白、反转录转座子的相关蛋白。其中蛋白激酶、核糖体小亚基蛋白和营养贮藏蛋白在其他报道中发现它们与植物的抗逆性有关。
(4)探讨低浓度重金属铅、锌(0.25mM)和胁迫时间(0-10天)与水花生叶片抗氧化系统之间的效应关系。结果表明：随处理时间的延长，锌、铅在叶片中大量积累，且铅的积累量大于锌。随着胁迫时间的延长，铅、锌都抑制了叶片对P、Mg的吸收，促进Mn、Na含量的提高。叶片的O2产生速率和MDA含量随胁迫时间的延长均显著提高，叶绿素含量和可溶性蛋白含量均降低。随着锌胁迫时间的延长，SOD活性降低、POD活性升高，CAT活性呈现出先升后降的趋势；铅胁迫下这3种酶活性都有不同程度的提高。铅、锌胁迫下叶片的AsA含量和脯氨酸含量都随处理时间的延长而提高，且铅处理下AsA含量和脯氨酸含量提高幅度较大：GSH含量随锌处理时间的延长而下降，随着铅处理时间的延长呈现先降后升的趋势。我们认为重金属的毒害程度随着胁迫时间的延长而逐步加深，在此过程中抗氧化酶和抗氧化剂的防御本领也逐步提高。
(5)研究了重金属锌、铅在槐叶苹体内的积累和锌、铅对营养元素的吸收、抗氧化酶活性和抗氧化剂含量、脯氨酸积累和细胞超微结构的影响。结果表明：随处理浓度的增加，锌、铅在槐叶苹体内大量积累，且铅的积累量大于锌。铅和锌单一处理都导致了槐叶苹体内P、Ca、Cu含量的降低。随着铅浓度升高，SOD、CAT和APX呈现先升后降的变化趋势；POD活性而迅速下降。而锌抑制了这些抗氧化酶的活性。随着锌、铅处理浓度的增加，叶绿素含量和可溶性蛋白含量均降低。与对照相比，Zn、Pb处理提高了O2-产生速率和MDA含量。脯氨酸含量和多胺氧化酶(PAO)活性随Pb处理浓度的增高而增加，Zn胁迫则表现为低浓度促进、高浓度抑制的特点。用透射电镜观察了锌、铅对叶细胞超微结构的损伤情况。电镜观察发现：锌、铅对细胞超微结构造成很大损伤。表现为细胞核核膜变形，核仁消失，染色质凝集；叶绿体膨胀，被膜断裂、消失甚至叶绿体解体；线粒体嵴突膨大和空泡化。