论文部分内容阅读
植物抗病反应被多种信号途径所调控,抗病基因激活表达是植物对多种病原菌产生响应至关重要的部分。WRKY转录因子是主要参与免疫反应转录调控大基因家族。世界葡萄生产中主栽品种欧洲葡萄(Vitis vinifera)大多不抗病,中国原产野生葡萄抗病性好,但其果实品质不及欧洲葡萄。为有效利用中国野生葡萄抗病相关基因改良欧洲葡萄抗病性,本研究从中国野生华东葡萄高抗白粉病株系白河-35-1中分离获得两个WRKY转录因子基因,并对其表达及功能进行了研究,主要取得以下结果:1、采用RACE技术对中国野生华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1叶片文库两个推定WRKY ESTs进行全长克隆,并命名为中国野生华东葡萄高抗白粉病株系白河-35-1转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2。其中,VpWRKY1 mRNA全长1157bp,开放阅读框969bp,编码322个AA,GenBank登录号为:GQ884198。VpWRKY2 mRNA全长1607bp,开放阅读框为1500bp,编码499个AA,GenBank登录号为GU565706。氨基酸序列同源性分析结果表明,VpWRKY1、VpWRKY2分属于WRKY大家族第III、I类。2、采用实时荧光定量PCR技术分析VpWRKY1和VpWRKY2在11个葡萄种质(中国野生华东葡萄抗白粉病株系抗病株系‘白河-35-1’、‘白河-13’、‘白河-13-1’、‘广西-1’与感病株系‘白河-35-2’、‘广西-2’、‘商南-2’、‘湖南-1’,感病的欧洲葡萄品种佳利酿及其中国野葡萄华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’和感病的欧洲葡萄品种佳利酿杂交F1代抗病和感病代表植株‘6-12-6’和‘6-12-2’)叶片中受白粉菌诱导的表达。结果表明,VpWRKY1和VpWRKY2在这11个葡萄种质叶片中都受白粉菌诱导先上调表达,再回到原始水平,上调表达最大值出现在接种后12h。此外,VpWRKY1表达在白河-35-1中被抗病信号分子SA诱导,而VpWRKY2则被三种抗病信号分子SA、JA和Eth诱导。半定量PCR分析VpWRKY1和VpWRKY2在中国野葡萄华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1组织特异性表达结果表明,VpWRKY1在根中几乎不表达,在茎中表达最强,叶片和卷须次之。VpWRKY2在茎中表达最强,叶片中表达次之,在根和卷须中表达最弱。3、采用基因枪介导的瞬时转化技术检测VpWRKY1和VpWRKY2在洋葱表皮细胞内定位。结果表明,这两个转录因子都定位在核内。此外,酵母单杂交和瞬时共表达研究结果证实,VpWRKY1在酵母菌株AH109及中国野生华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1叶片中都具有转录激活活性,而VpWRKY2仅在白河-35-1叶片中有转录激活活性。4、采用农杆菌介导的花序浸沾法获得转化VpWRKY1和VpWRKY2基因拟南芥株系,进一步分析结果表明,转基因株系对白粉病抵抗力增强。此外,转化VpWRKY2基因拟南芥幼苗对烟草疫霉菌抵抗提高,但转化VpWRKY1基因拟南芥幼苗对烟草疫霉病抗性未发生变化。5、实时荧光定量PCR检测转基因拟南芥株系中抗病相关基因AtPR1、AtPR10、AtNPR1、AtCOR1和AtPDF1.2表达结果表明,多数抗病相关基因在转基因株系中的表达发生变化。同时,葡萄抗病相关基因VpPR1、VpPR10及VvNPR1的表达在瞬时转化VpWRKY1和VpWRKY2的中国野生华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1组培苗叶片中也显著发生变化。说明抗病基因表达可能受VpWRKY1和VpWRKY2调控。6、采用同源序列法设计引物克隆获得VpWRKY1和VpWRKY2基因启动子PvpWRKY1和PvpWRKY2。PvpWRKY1长694bp,GenBank登录号为GU565705。PvpWRKY2长643bp,GenBank登录号为HQ174899。在瞬时转化的中国野生华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1组培苗叶片中,PvpWRKY1::GUS和PvpWRKY2::GUS融合蛋白的表达被葡萄白粉菌诱导上调,属病原菌诱导型启动子。