论文部分内容阅读
亨廷顿病（Huntingtons Disease，HD）是一种致命的常染色体显性遗传神经退行性疾病，其主要特点是躯体和四肢不可控制的舞蹈样运动，渐进性认知能力下降和精神障碍，主要病理特征为大脑纹状体区中型棘突神经元(MSN)逐渐丢失。HD由亨廷顿蛋白（Huntingtin，HTT）N端聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)异常延伸导致。HTT蛋白大小为349 kD，在各个组织中广泛表达，但其主要功能并不清楚。已有研究表明，HD病人神经元中诸多与神经功能相关的基因异常表达，但调控基因表达紊乱的分子机制并不清楚。 DNA胞嘧啶羟甲基化(5hmC)是一种新的DNA表观遗传修饰，由TET家族蛋白以甲基化胞嘧啶(5mC)为底物催化生成。DNA胞嘧啶羟甲基化广泛存在于中枢神经系统终末分化神经元中，具有调控基因表达的功能。因此，本研究拟回答的关键问题是:DNA羟甲基化是否与HD发病相关。 用HD模型小鼠YAC128作为研究对象，通过DNA斑点杂交，免疫荧光以及化学标记5hmC结合二代测序等方法，研究了小鼠纹状体和大脑皮层区中全基因组胞嘧啶羟甲基化的水平及分布。我们发现与野生型小鼠相比，YAC128纹状体和大脑皮层区域的DNA5hmC水平异常降低。通过两两比较，鉴定了WT和YAC128小鼠纹状体和大脑皮层中DNA羟甲基化差异区域(DhmRs)及相关基因。羟甲基化水平改变的基因主要参与了调控神经元存活和功能性的轴突引导，并影响了多个重要信号通路，如GABA受体通路、谷氨酸受体通路、cAMP-多巴胺-DAPRR32环路通路、mTOR通路及突触长时程抑制通路等。同时还发现与神经干细胞增殖与分化以及神经发生相关的Wnt/β-catenin/sox信号通路也受到了很大影响。此外，分析了羟甲基化水平与基因表达量的关系，发现基因羟甲基化水平上升可正调控相关基因的表达。这些结果都显示5hmC表观修饰的异常可能影响了HD发病过程中重要相关信号通路基因的表达，提示5hmC表观修饰异常可能参与了HD的病理发生进程。 另外，分析了DNA5hmC对小鼠发育过程的调控作用，结果发现在个体发育过程中，WT和YAC128小鼠纹状体及皮层区域的DNA羟甲基化水平呈动态变化，具体表现为:从1.5到3月龄整体水平呈上升趋势;而从3到8月龄呈显著下降趋势;在我们检测的三个时间点中，3月龄时达到峰值。此外，我们的结果显示，5hmC在基因编码区信号较强，在基因转录起始区域及转录结束区域信号显著较低;在基因内CpG岛中水平较高，而在启动子区域及基因间CpG岛中水平显著降低，这是5hmC在基因组上分布的保守性特征。然而，5hmC在不同组织基因中的分布模式并不相同，说明其具有很强的组织特异性，这些结果提示5hmC可能参与了组织特异性基因的表达调控。 高通量测序及DNA斑点杂交结果还显示，在YAC128小鼠纹状体及皮层中，线粒体DNA羟甲基化水平也显著低于野生型。此外，通过对线粒体DNA DhmRs相关基因进行表达量检测，我们发现在线粒体基因组中，基因内5hmC水平与基因表达量无显著相关性。 综上，结果表明:DNA表观遗传修饰5hmC特异性丢失是HD中一种新的表观遗传特征，并且这种修饰异常调控了纹状体区域神经元的存活和功能以及神经干细胞的增殖与分化。研究结果为HD治疗提供了新靶点，重建神经元5hmC修饰可能会延缓或阻止HD的发病及进展。