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环境污染导致镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铅(Pb)等有毒重金属在自然水体中的大量积累,威胁水生生物的生存,并通过饮用水和水产品进入人体。因此,开展有毒重金属在生物体和细胞中吸收、积累和排泄分子机制的研究,对保护水生生物多样性和人体健康具有重要意义。研究发现,在重金属慢性暴露条件下某些多药耐药相关蛋白(MRP)的诱导表达可使哺乳动物细胞获得重金属抗性,显示MRP在组织防御和有毒物质排泄中起重要作用。目前,对鱼类MRP功能尤其在重金属解毒中作用的研究还很少。本文分析了斑马鱼ZF4细胞在重金属慢性暴露条件下形成抗性的能力,克隆了斑马鱼abcc1,abcc2,abcc4,abcc5等基因的cDNA,检测了这些基因在胚胎和成体中的正常转录表达和重金属诱导效应,探讨了相关蛋白在重金属解毒和胚胎发育中的作用与机制,取得了如下结果。
1)用低浓度Cd长期筛选斑马鱼ZF4细胞,得到对Cd、Hg、As3+和As5+等重金属具有交叉抗性的ZF4-Cd细胞。与正常的ZF4细胞(ZF4-WT)相比,ZF4-Cd细胞对这些重金属的抗性分别升高了1.42、1.40、1.56和2.88倍；ZF4-Cd细胞的MRP转运活性和Cd排泄能力显著增强；ZF4-Cd细胞中abcc2、abcc4等基因的表达量和GSH含量显著升高,抑制MRP的活性又能削弱其对重金属的抗性。这些结果显示,MRP转运蛋白在斑马鱼细胞对重金属的解毒中具有重要作用。
2)斑马鱼abcc1基因位于3号染色体,包含34个外显子。斑马鱼ABCC1由1518个氨基酸组成,与人ABCC1之间具有70％的序列同源性。斑马鱼早期胚胎中具有高水平的母源性abcc1表达；在斑马鱼幼体中,abcc1主要在鳃、脑和眼中表达；在斑马鱼成体中,abcc1在多种组织中表达,其中精巢和卵巢的表达量最高。Cd、Hg、As和Pb等重金属处理均能诱导斑马鱼abcc1基因在ZF4细胞和斑马鱼胚胎中的表达。将pRc/CMV2-ABCC1显微注射入斑马鱼胚胎,过表达的ABCC1能增强胚胎对Cd、Hg和As5+的耐受性；注射pRc/CMV-ABCC1-G1420后过表达的显性失活突变体ABCC1-G1420D,可抑制内源性ABCC1的活性,显著降低胚胎对这些重金属的耐受性,表明斑马鱼ABCC1是鱼体中广泛分布的重金属解毒因子。
3)斑马鱼abcc2基因位于13号染色体,包含32个外显子。斑马鱼ABCC2由1567个氨基酸组成,与人ABCC2之间具有57％的序列同源性。斑马鱼早期胚胎中没有abcc2的表达,72 hpf时才检测到其在肝脏和肠道中的表达；在斑马鱼幼体中,abcc2的特异性表达出现在肝脏、肠道和肾脏中；在斑马鱼成体中,abcc2主要在肝脏、肠道和肾脏中特异表达,脑和肌肉中也有少量表达。Hg和Pb处理能显著诱导abcc2在斑马鱼幼体和成体肝脏、肠道和肾脏中的表达。用pRc/CMV-ABCC2-Flag转染ZF4细胞或显微注射斑马鱼胚胎,分别用MRE和EPRE驱动的荧光素酶报告基因监测细胞内Cd和Hg的相对浓度,并用原子吸收测定Pb的浓度,研究过表达ABCC2对重金属在ZF4细胞和斑马鱼胚胎中积累的影响,结果表明过表达ABCC2能显著降低Cd和Hg在ZF4细胞中的积累,以及Cd,Hg和Pb在斑马鱼胚胎中的积累,说明斑马鱼ABCC2具有从细胞中排出重金属的功能。由于斑马鱼ABCC2主要在肝脏、肠道和肾脏等排泄器官中表达,说明其可能在机体对重金属的排泄中起重要作用。
4)斑马鱼abcc4基因位于6号染色体,包含30个外显子。斑马鱼ABCC4由1327个氨基酸组成,与人ABCC4之间具有69％的序列同源性。斑马鱼早期胚胎具有高水平的母源性abcc4表达；在斑马鱼幼体中,abcc4主要在鳃、口咽腔、肠道、肾脏和鳔中表达；在斑马鱼成体中,abcc4在卵巢和精巢中表达量最高,肠道、肾脏、眼和脑中也有少量表达,其它组织的表达量很低。Hg和Pb处理斑马鱼幼体能诱导abcc4在鳃、口咽腔、肾脏和肠道中的表达,处理斑马鱼成体能诱导abcc4在鳃、肾脏和肠道中的表达。这些结果表明斑马鱼ABCC4可能具有从肾脏和肠道中排泄重金属,以及限制重金属通过口咽腔和鳃吸收的作用。
5)斑马鱼abcc5基因位于18号染色体,包含28个外显子。斑马鱼ABCC5由1426个氨基酸组成,与人ABCC5之间具有73％的序列同源性。斑马鱼早期胚胎中有较低水平的母源性abcc5表达；在斑马鱼幼体中,abcc5主要在脑、眼、肝脏、肠道和鳔中表达；在斑马鱼成体中,abcc5在多种组织中广泛表达,其中精巢和脑中表达量最高。显微注射pRc/CMV-ABCC5-G1322D过表达显性失活突变体ABCC5一G1322D,抑制内源性ABCC5可导致胚胎发育迟缓。抑制内源性ABCC5升高了胚胎细胞内cGMP含量,激活p21和mdm2等介导的细胞周期阻滞,从而导致胚胎产生发育迟缓的表型,说明斑马鱼ABCC5能够通过调控细胞内cGMP水平而影响胚胎发育。Cd、Hg、As和Pb等重金属处理都能诱导斑马鱼abcc5基因在ZF4细胞和斑马鱼胚胎中的表达。用pRc/CMV2-ABCC5显微注射斑马鱼胚胎,过表达的ABCC5能增强胚胎对Cd的耐受性,说明斑马鱼ABCC5也具有重金属解毒的作用。
上述结果表明,斑马鱼abcc1、abcc2、abcc4和abcc5基因都能被重金属诱导表达,而且都具有重金属解毒和排泄的功能,根据其组织分布和亚细胞定位的特点,在重金属应激条件下能够共同作用将重金属从不同类型的细胞和组织中排出,从而对机体起到保护作用。