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肺癌是当前世界各国常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75%~85%，针对晚期NSCLC的治疗，目前已经开始从传统化疗药物治疗转变到分子靶向治疗的新阶段。吉非替尼（Gefitinib）是晚期NSCLC治疗的首个靶向药物，具有特异性好，起效快，不良反应少的特点。虽然吉非替尼对NSCLC患者显示出较好的治疗效果，但由于耐药问题的存在严重限制了本药的应用。STAT3是信号转导转录活化蛋白家族（Signal transducers and activators oftranscription，STAT）的一员，广泛表达于不同类型的细胞和组织中，介导多种细胞因子信号向细胞核内传导，影响众多靶基因的转录。有报道称，STAT3的siRNA或抑制剂如JSI-124、AG490、Stattic等，通过抑制STAT3激活，增强了NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性，改善了吉非替尼在NSCLC细胞中的作用。但是，STAT3介导吉非替尼耐药的机制还不是很明确，需要进一步研究。本文选用几种非小细胞肺癌细胞株，观察吉非替尼作用后对细胞中EGFR和STAT3活性的影响，并采用Western blot、RNA干扰、免疫共沉淀等方法深入研究STAT3抵抗吉非替尼作用的机制。第一部分STAT3持续激活抵抗吉非替尼的作用本部分的实验主要是在细胞水平上比较了几种非小细胞肺癌中STAT3的活性，并观察吉非替尼作用后对几种非小细胞肺癌中EGFR及STAT3活性的影响。结果表明在带有EGFR突变的H1975、HCC827细胞中STAT3的活性明显强于EGFR野生型的A549细胞。虽然吉非替尼能够显著抑制H1975、HCC827以及A549细胞中EGFR的磷酸化，然而在相同的浓度及时间下吉非替尼对这三种细胞中STAT3的705位酪氨酸的磷酸化并没有显著的抑制作用。提示，STAT3的异常活化可能影响吉非替尼的作用。同时联合运用STAT3的抑制剂Stattic和吉非替尼后能够显著增强吉非替尼抑制H1975细胞增殖的作用。进一步证明STAT3持续激活影响了吉非替尼在H1975细胞中的作用。第二部分STAT3持续激活抵抗吉非替尼作用的机制1、EGFR突变对STAT3抵抗吉非替尼作用的影响本文成功稳定转染了表达EGFR外显子20插入突变的NIH3T3细胞株。随后利用Western blot检测发现稳定转染的NIH3T3细胞中过表达的EGFR促进了p705-STAT3的磷酸化，且发现这种活化的STAT3可以被吉非替尼所抑制。说明STAT3持续激活抵抗吉非替尼的作用具有细胞选择性。进一步利用RNA干扰EGFR研究H1975细胞中EGFR对STAT3活性的影响。发现当EGFR的shRNA转染H1975细胞后，EGFR表达减少，相应的STAT3的705位的磷酸化的水平出现明显下调，表明STAT3持续激活抵抗吉非替尼的作用与H1975细胞中EGFR自身分子表达有关。2、Gp130/JAK信号通路对STAT3持续激活的影响Gp130/JAK信号通路是激活STAT3的主要通路，本部分实验比较了A549、H1975细胞中JAK1与JAK2的活性，发现这两种细胞中JAK1与JAK2的活性没有显著性的差异，但是发现H1975细胞中JAK1/JAK2异二聚体的形成明显多于A549细胞，这可能是H1975中STAT3高活化的一个因素。进而检测JAK1与JAK2上游gp130受体对STAT3活性的影响，发现在H1975细胞中利用RNA干扰敲除gp130，相应地阻断了STAT3（Y705）的磷酸化，表明STAT3持续激活抵抗吉非替尼的作用与H1975细胞中gp130表达有关。Gp130是细胞因子的膜上受体，介导gp130/JAK/STAT3信号通路传导，促进STAT3的激活。因此利用细胞因子芯片首先检测了H1975细胞中一些细胞因子的表达水平，发现在H1975细胞分泌上清中只有IL-6与STAT3的联系最为密切。为了发现其它的可能影响STAT3激活的细胞因子，利用放线菌酮作用H1975细胞，发现其条件培养基不能阻断H1975细胞中STAT3的激活。然而FBS（含IL-6）以及外加重组表达IL-6作用H1975细胞后，发现均不影响H1975细胞中STAT3的激活。上述实验表明，H1975细胞中STAT3的激活不依赖于细胞自身分泌的细胞因子。上述研究表明STAT3的激活与H1975细胞中的EGFR以及gp130分子有关，而与其分泌的细胞因子IL-6无关，说明H1975细胞内存在STAT3的自身异常激活。考虑到H1975细胞是一个EGFR突变的细胞，EGFR/HER2异二聚体形成远高于A549且EGFR/HER2异二聚体能够通过HER2介导STAT3的激活。为了探讨gp130、EGFR与HER2三者之间的关系，我们利用RNA干扰gp130，研究其对H1975细胞中EGFR/HER2异二聚化形成的影响。研究表明，gp130敲除后，EGFR与HER2的结合明显减少，提示gp130参与了EGFR/HER2异二聚化的形成。进一步说明了STAT3的持续激活与gp130/EGFR/HER2复合分子的形成有关。3、吉非替尼作用对H1975细胞中socs-3的影响细胞内STAT3激活还与细胞内源性的多种负向调控有关。因此采用Westernbloting方法进一步对影响gp130/JAK/stat3通路的内源性负向调控分子socs-3进行了研究。结果发现吉非替尼能够时间依赖性抑制H1975细胞中socs-3的表达，解除了STAT3的一个重要的细胞中内源性负向调控，维持细胞中STAT3的持续激活。这种作用与吉非替尼抑制ERK1/2活化有着密切的关系。本论文研究表明H1975细胞gp130/EGFR/HER2复合物的形成，促进了EGFR/HER2通路与gp130/JAK通路相互对话，引起JAK1/JAK2二聚化增多，最终导致STAT3组成型激活，同时吉非替尼作用抑制了细胞中socs-3的表达，影响了该通路的内源性负向调控，从而维持细胞中STAT3持续活化。综上所述，H1975细胞中STAT3由于存在不依赖EGFR活化的激活，而对吉非替尼作用形成原发性抵抗；同时吉非替尼作用后抑制了socs-3的表达，减少了针对STAT3的内源性负向调控，形成对吉非替尼作用的继发性抵抗；两方面共同作用促进了STAT3持续活化，从而介导其抵抗吉非替尼的作用。本论文研究结果明确了STAT3持续激活参与吉非替尼作用抵抗的机制，表明抑制gp130/EGFR/HER2复合物的形成是降低STAT3活化的一条重要途径，这为今后开发拮抗吉非替尼耐药药物提高吉非替尼的作用疗效提供了新的潜在的作用靶标，对新药研发具有重要的理论意义与应用价值。