论文部分内容阅读
目的探究miR-99a-5p和miR-639在骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓细胞中的表达水平情况,并且分析其与患者临床病理参数的相关性,同时利用miRNA靶基因在线预测软件等生物信息学方法对两者的靶基因进行预测及功能分析,探讨miR-99a-5p和miR-639在MDS疾病过程中的意义,以期为MDS发病机制研究及临床诊疗工作中提供新的理论依据。方法首先应用miRNA表达谱芯片结合分层聚类的方法分别对9例MDS患者（5例IPSS低、中危和4例IPSS高危患者）和6例健康对照组骨髓细胞中miR-99a-5p和miR-639的表达情况进行检测。然后利用实时定量逆转录PCR（Real-time PCR）技术在52例初诊MDS患者（包括31例IPSS低危和中危1在内的相对低危组患者、21例IPSS中危2和高危在内的相对高危组患者）、18例初诊MDS转急性髓系白血病（以下简称“转白”）患者及19例健康对照组的骨髓细胞中miR-99a-5p和miR-639的表达水平进行验证,并分析两者在MDS不同亚组的表达情况,然后分别探索两者与包括染色体核型分析、外周血血象（中性粒细胞绝对值、血红蛋白量及血小板计数）和骨髓原始细胞比例在内的临床病理参数的相关性,运用Miranda、Targetscan和Microcosm三种靶基因在线分析软件分别预测miR-99a-5p和miR-639可能的靶基因,取其预测结果的交集,通过进行基因功能富集分析（GO-analysis）和信号转导通路富集分析（KEGG Pathway analysis）,并进一步结合现有相关的靶基因文献报道选出最终可能的潜在靶基因。结果1.miRNA表达谱芯片结合分层聚类结果显示在MDS患者中有92个miRNA表达显著上调（比值R≥2）和198个miRNA表达显著下调（比值R≤0.5）。其中,miR-99a-5p呈现表达水平的上调（R=4.42,p<0.05）,miR-639表达水平出现下调（R=0.18,p<0.01）。2.利用Real-time PCR技术在大样本MDS患者及MDS转白患者骨髓细胞中分别对miR-99a-5p和miR-639表达水平进行验证,结果显示:与健康对照组相比,miR-99a-5p在总MDS样本骨髓中呈显著高表达(R=4.69,p=5.05×10-13),与基因芯片的结果一致,其中相对低危组（低危组和中危1组）的表达量是对照组的2.40倍(p=9.61×10-4),相对高危组（中危2组和高危组）的表达量是对照组的6.66倍(p=2.65×10-8),MDS转白组的表达量是对照组的6.35倍(p=5.66×10-6)。miR-639在总MDS样本骨髓中的表达水平相较健康对照组则呈现显著下调（R=0.64,p=7.90×10-5）,与基因芯片结果一致,其中相对低危组（低危组和中危1组）的表达量与对照组相比差异无统计学意义（p=0.46）,相对高危组（中危2组和高危组）的表达量是对照组的0.42倍(p=1.06×10-7),MDS转白组的表达量是对照组的0.41倍(p=1.29×10-7)。3.将miR-99a-5p和miR-639在所有MDS患者（包括MDS转白患者）中的表达量分别与MDS患者临床病理参数进行相关性分析结果显示:患者染色体核型分析情况与miR-99a-5p表达量无明显差异（异常组:2.89±1.31正常组:2.00±1.93,p=0.12）,外周血血象与其表达量之间无明显相关（中性粒细胞绝对值:r=-0.252,p=0.094;血红蛋白量:r=0.016,p=0.913;血小板计数:r=0.241,p=0.107）,但骨髓原始细胞比例与其表达量呈正相关(r=0.645,p=1.33×10-6)。而miR-639的表达量与MDS患者染色体核型分析情况呈现相关性（C=0.378,p=0.010）,并且miR-639在染色体异常组的表达量相较染色体正常组低（异常组:0.54±0.29正常组:0.79±0.31,p=0.015）,外周血血象与其表达量之间同样无明显相关（中性粒细胞绝对值:r=0.033,p=0.829;血红蛋白量:r=-0.036 p=0.809;血小板计数:r=-0.148,p=0.326）,骨髓原始细胞比例与其表达量则呈负相关(r=-0.527,p=1.42×10-4)。4.运用Miranda、Targetscan和Microcosm三种靶基因在线分析软件分别对miR-99a-5p和miR-639的靶基因进行预测并取其结果的交集显示:miR-99a-5p可能的靶基因12个,而miR-639可能的靶基因4个。miR-99a-5p和miR-639可能靶基因基因功能富集分析和信号转导通路富集分析结果显示:miR-99a-5p的靶基因功能主要富集于有机环化合物、DNA、核酸等的结合和蛋白磷酸酶、转移酶等的激活及RNA生物合成过程、转录过程等的调控（p<0.05）,信号通路主要富集于白细胞跨内皮转移信号转导通路、肿瘤蛋白聚糖信号转导通路等（p<0.05）。miR-639的靶基因功能富集于有机环化合物、特定序列DNA、核酸等的结合和特定序列DNA结合转录因子的活性及RNA代谢过程、转录过程等的调控（p<0.05）,尚未得到有关靶基因的相关信号转导通路。结合miRNA负调控原理及现有关于miR-99a-5p和miR-639预测的靶基因的相关文献报道得出:miR-99a-5p最终可能潜在的靶基因为ST5,miR-639最终可能潜在的靶基因为POU2F2。结论1.miR-99a-5p的表达水平与MDS骨髓原始细胞比例呈正相关,高表达的miR-99a-5p可能参与了MDS疾病的发生发展过程。2.与正常对照组相比,miR-639在MDS相对低危组（低危组和中危1组）患者骨髓细胞的表达量无明显差异,而在相对高危组（中危2组和高危组）及转白组患者骨髓细胞中表达显著降低;在所有MDS患者（包括MDS转白患者）中,miR-639的表达水平与骨髓原始细胞比例呈负相关,并且染色体异常组的患者骨髓细胞中miR-639的表达量相对染色体正常组更低。以上提示低表达的miR-639可能参与了MDS疾病的进展。3.miR-99a-5p可能通过靶向负调控ST5而参与了MDS发生发展的过程。4.miR-639可能通过负调节靶基因POU2F2而参与了MDS疾病的进展。