论文部分内容阅读
马立克氏病(Marek’s disease, MD)是鸡的一种高度接触性肿瘤病,其主要特征是淋巴组织增生和肿瘤的形成。马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)包括三种血清型：血清1型(MDV-1)属于能引起肿瘤的MDV,血清2型(MDV-Ⅱ)属于天然不致瘤的MDV,火鸡疱疹病毒(HVT)属于血清3型(MDV-Ⅲ)。2001年,本实验室张志等从中国广西省某鸡场分离得到一株自然重组禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的1型MDV野毒株GX0101。为了解GX0101的生物学活性,我们使用细菌人工染色体(BAC)技术构建了GX0101的BAC克隆BAC-GX0101,在BAC-GX0101的基础上,敲除两个致肿瘤的meq基因,同时诱导掉重组过程中插入的Kan+表达盒,得到了meq基因缺失株MDV GXO101△meq△Kan,即SC9-1株MDV。研究表明,SC9-1株不仅失去了1型MDV的致病性而且能够提供比商品化CVI988/Rispens疫苗更好的免疫保护效果。在SC9-1的基础之上,我们通过cre-loxp重组系统进一步敲除SC9-1中的BAC骨架得到SC9-2株MDV,本研究旨在比较不同代次SC9-2的生物学活性及以SC9-1为载体构建表达NDV-F基因的重组MDV。1.SC9-1中细菌人工染色体(BAC)序列自我敲除的分子鉴定为了对缺失meq基因的MDV SC9-1感染性克隆基因组中BAC的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1-10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。同时利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示：1-5代的病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6-10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒的基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR的结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre-loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将SC9-1中的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度的一致性。2.马立克氏病病毒疫苗株SC9-2在CEF细胞上的传代致弱及其免疫抑制作用和保护效果的评估MD是由α-疱疹病毒MDV引起的鸡的一种淋巴组织增生性疾病。之前的研究表明,敲除meq基因的超强MDV (w MDV)能够提供比商品化CVI988/Rispens更好的免疫保护,而且在鸭胚成纤维细胞(DEV)连续传40代后能够消除病毒在母源抗体阴性鸡中引起的免疫器官(胸腺和法氏囊)萎缩以及体重的减轻。本研究中,我们将meq基因敲除株SC9-2株MDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代。结果表明,接种40代SC9-2(SC9-2/40th)的SPF鸡的体重及胸腺和法氏囊相对于体重的指数要高于免疫10代SC9-2(SC9-2/10th)的SPF鸡,但都显著低于空白对照组。SC9-2/40th和809-2/10th对于禽流感(AIV)和新城疫(NDV)灭活苗产生的抗体水平差异不显著,但都低于空白对照组,而且存在显著差异。接种809-2/40th的SPF鸡在羽毛囊中的病毒载量要低于809-2/10th的病毒载量,但是免疫保护效果没有差异,同时免疫保护指数明显好于CVI988/RispenS。所有结果表明,SC9-2/40th的免疫抑制显著降低,但仍需要继续传代减弱免疫抑制。本研究为细胞传代致弱缺失meq基因的超强MDV提供了依据。3.表达NDV-F基因重组MDV的构建及其在鸡体内外的复制以敲除meq基因的MDV-I型弱毒SC9-1 (GX0101△meq△Kan)为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1 (-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体pMD18-T中。用含有MDV-US2区50 bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有SC9-1的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组MDVrMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以SC9-1为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。