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非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要类型,约75%的非小细胞肺癌患者在发现时已处于中晚期,缺乏有效的疗法(对放疗和化疗不敏感),耐药是NSCLC治疗失败及病情快速进展的主因,临床上缺乏准确有效且便捷的方法来评估NSCLC耐药情况.研究表明多药耐药基因(MDR1)和肺耐药蛋白(LRP)基因的表达在NSCLC多药耐药机制中发挥着重要作用,MDR1和LRP基因的异常表达提示肺癌患者的耐药和不良预后.因此在难以获得NSCLC癌组织标本的情况下,以外周血为样本检测MDR1和LRP的表达水平,作为指导化疗用药及预后评估的指标,可作为临床评估NSCLC耐药的辅助诊断方法,为化疗方案的及时调整、个体化治疗的有效性监测提供有益的指导,最终达到延长患者生存期的目的.
荧光检测技术及电化学分析技术由于具有操作简便、响应迅速、高特异性及良好的抗干扰性等特点,已广泛用于生物传感领域;利用具有特殊结构且优异性能的导电聚合物和纳米材料,将氧化石墨烯、纳米多孔材料及纳米金颗粒/聚合物复合材料引入作为传感界面,能显著提高DNA传感器检测的灵敏度及稳定性.多数荧光/电化学生物传感器需要进行标记以指示信号,标记操作可能涉及复杂的制备过程,存在被标记生物分子活性受损、标记效率有限及成本较高等不足.基于以上考虑,本文构建了四种新型的免标记生物传感体系,用于MDR1和LRP基因的高灵敏检测,为实现临床上NSCLC化疗过程中的实时耐药监测奠定研究基础.本文的主要研究内容包括以下四个部分:
一、基于SYBR GreenⅠ和氧化石墨烯(GO)的免标记荧光传感器用于MDR1基因检测
选择具有良好光学性能的核酸染料SYBR GreenⅠ(SGⅠ),根据SGⅠ与单、双链DNA作用方式的差异建立开关型荧光生物传感器,同时利用GO优异的负载及淬灭SGⅠ空白信号降低背景响应的能力,建立基于SGⅠ和GO的MDR1基因检测新方法.荧光测定杂交前后光学信号的差异判断该方法的可行性.优化实验条件,该传感器能很好的区分杂交液中的完全互补DNA与及错配序列,体现良好的特异性,线性范围为1.0×10-9~5.0×10–8mol/L,检测限为5.0×10-10mol/L;稀释后血清中MDR1的测定结果表明该方法呈现良好的抗干扰能力,能实现复杂体系下MDR1基因片段特异且灵敏的检测,为临床多药耐药基因的监测提供新的方法选择.
二、基于纳米金/聚刚果红复合材料的免标记电化学DNA传感器用于MDR1基因检测
电聚合法在玻碳电极表面制备聚刚果红膜,随后循环伏安法在氯金酸硫酸溶液中实现纳米金在聚刚果红膜上的沉积,构建纳米金/聚刚果红膜修饰电极.扫描电镜表征电聚合圈数对纳米金/聚刚果红膜形貌的影响,交流阻抗法和循环伏安法对修饰电极的性能进行对比表征、EDS分析界面元素组成,确定纳米金/聚刚果红膜的最佳制备条件.在此基础上,选择六氨合钌为杂交指示剂,用于MDR1基因的检测.最佳的实验条件下,六氨合钌的还原峰电流信号与MDR1基因浓度在3pM~5nM之间呈良好的线性对数关系,最低检测限达2.0×10-13mol/L,且呈现良好的选择性及抗干扰能力,与荧光法测定MDR1基因结果相比,灵敏度得到了提高,有利于实际应用.
三、基于花状纳米金电极的免标记电化学DNA传感器用于LRP基因的检测
电化学沉积法精确控制沉积时间和电位,一步法制得花状纳米金电极.扫描电子显微镜表征金纳米花的表面形态,X射线衍射法考察产物金的晶面取向,同时通过电化学表征手段考察修饰电极性能,应用多巴胺/抗坏血酸混合液考察制备花状纳米金电极的选择催化性能.在此基础上,以亚甲基蓝为杂交指示剂,构建制备简单、重现性好的免标记电化学DNA传感器检测LRP基因.研究表明,在1.5pM~1.0nM浓度范围内,亚甲基蓝还原峰电流信号变化值与目标基因浓度的对数呈线性关系,检测限为1.2×10-13mol/L,可实现LRP基因的准确检测.
四、基于纳米多孔金电极的免标记电化学DNA传感器用于LRP基因的检测
在第三部分的基础上,通过由低频到高频分步对金电极进行方波伏安处理制备界面均匀有序的纳米多孔金电极,扫描电镜表征分步反应制备的金电极的形貌变化,并结合EDS和电化学方法对修饰电极的元素构成及电化学性能进行考察.以硫堇为杂交指示剂,构建LRP基因的高灵敏检测新方法.结果表明,分步方波伏安法有助于制备规则均匀的纳米多孔金结构,且可明显改善硫堇分子与DNA作用之后的电化学响应,有利于提高LRP基因的检测性能.在2.0×10-13~7.5×10-9mol/L的线性范围,硫堇的还原峰电流与LRP靶基因序列呈现良好的线性对数关系,最低检测限为3.0×10-14mol/L,提高了检测灵敏度,为实现临床外周血中LRP基因的检测提供了良好的实验研究基础.
荧光检测技术及电化学分析技术由于具有操作简便、响应迅速、高特异性及良好的抗干扰性等特点,已广泛用于生物传感领域;利用具有特殊结构且优异性能的导电聚合物和纳米材料,将氧化石墨烯、纳米多孔材料及纳米金颗粒/聚合物复合材料引入作为传感界面,能显著提高DNA传感器检测的灵敏度及稳定性.多数荧光/电化学生物传感器需要进行标记以指示信号,标记操作可能涉及复杂的制备过程,存在被标记生物分子活性受损、标记效率有限及成本较高等不足.基于以上考虑,本文构建了四种新型的免标记生物传感体系,用于MDR1和LRP基因的高灵敏检测,为实现临床上NSCLC化疗过程中的实时耐药监测奠定研究基础.本文的主要研究内容包括以下四个部分:
一、基于SYBR GreenⅠ和氧化石墨烯(GO)的免标记荧光传感器用于MDR1基因检测
选择具有良好光学性能的核酸染料SYBR GreenⅠ(SGⅠ),根据SGⅠ与单、双链DNA作用方式的差异建立开关型荧光生物传感器,同时利用GO优异的负载及淬灭SGⅠ空白信号降低背景响应的能力,建立基于SGⅠ和GO的MDR1基因检测新方法.荧光测定杂交前后光学信号的差异判断该方法的可行性.优化实验条件,该传感器能很好的区分杂交液中的完全互补DNA与及错配序列,体现良好的特异性,线性范围为1.0×10-9~5.0×10–8mol/L,检测限为5.0×10-10mol/L;稀释后血清中MDR1的测定结果表明该方法呈现良好的抗干扰能力,能实现复杂体系下MDR1基因片段特异且灵敏的检测,为临床多药耐药基因的监测提供新的方法选择.
二、基于纳米金/聚刚果红复合材料的免标记电化学DNA传感器用于MDR1基因检测
电聚合法在玻碳电极表面制备聚刚果红膜,随后循环伏安法在氯金酸硫酸溶液中实现纳米金在聚刚果红膜上的沉积,构建纳米金/聚刚果红膜修饰电极.扫描电镜表征电聚合圈数对纳米金/聚刚果红膜形貌的影响,交流阻抗法和循环伏安法对修饰电极的性能进行对比表征、EDS分析界面元素组成,确定纳米金/聚刚果红膜的最佳制备条件.在此基础上,选择六氨合钌为杂交指示剂,用于MDR1基因的检测.最佳的实验条件下,六氨合钌的还原峰电流信号与MDR1基因浓度在3pM~5nM之间呈良好的线性对数关系,最低检测限达2.0×10-13mol/L,且呈现良好的选择性及抗干扰能力,与荧光法测定MDR1基因结果相比,灵敏度得到了提高,有利于实际应用.
三、基于花状纳米金电极的免标记电化学DNA传感器用于LRP基因的检测
电化学沉积法精确控制沉积时间和电位,一步法制得花状纳米金电极.扫描电子显微镜表征金纳米花的表面形态,X射线衍射法考察产物金的晶面取向,同时通过电化学表征手段考察修饰电极性能,应用多巴胺/抗坏血酸混合液考察制备花状纳米金电极的选择催化性能.在此基础上,以亚甲基蓝为杂交指示剂,构建制备简单、重现性好的免标记电化学DNA传感器检测LRP基因.研究表明,在1.5pM~1.0nM浓度范围内,亚甲基蓝还原峰电流信号变化值与目标基因浓度的对数呈线性关系,检测限为1.2×10-13mol/L,可实现LRP基因的准确检测.
四、基于纳米多孔金电极的免标记电化学DNA传感器用于LRP基因的检测
在第三部分的基础上,通过由低频到高频分步对金电极进行方波伏安处理制备界面均匀有序的纳米多孔金电极,扫描电镜表征分步反应制备的金电极的形貌变化,并结合EDS和电化学方法对修饰电极的元素构成及电化学性能进行考察.以硫堇为杂交指示剂,构建LRP基因的高灵敏检测新方法.结果表明,分步方波伏安法有助于制备规则均匀的纳米多孔金结构,且可明显改善硫堇分子与DNA作用之后的电化学响应,有利于提高LRP基因的检测性能.在2.0×10-13~7.5×10-9mol/L的线性范围,硫堇的还原峰电流与LRP靶基因序列呈现良好的线性对数关系,最低检测限为3.0×10-14mol/L,提高了检测灵敏度,为实现临床外周血中LRP基因的检测提供了良好的实验研究基础.