论文部分内容阅读
【背景及目的】： 背景：白藜芦醇(resveratrol，RSV)即3,4’,5-三羟基-1,2-二苯乙烯(3,4,5-trihydroxystilbene;C14H12O3)在自然界中分布广泛，是一种具有很强的生物性的天然的多酚类化合物，尤其在葡萄、红酒、蓝莓、桑葚、花生、虎杖等植物和食品中的含量非常丰富。目前白藜芦醇在心血管和癌症方面的功能已经得到大量实验证明，显示了其在抗氧化，抗癌，抑制炎症等生物学上的作用。研究表明白藜芦醇可以抑制肿瘤细胞生长，但其对于不同的肿瘤细胞，其抗肿瘤机制是不一样的；白藜芦醇能诱导不同种类的肿瘤细胞发生凋亡性死亡或者是自噬性死亡，但二者之间的相互关系以及机制尚不明确。已有文献表明，白藜芦醇诱导HL-60死亡能通过凋亡途径，但自噬是否在此过程中存在，并是何种功能，尚未得到研究和重视。本实验以人急性早幼粒白血病HL-60细胞作为研究对象，重点对白藜芦醇抑制该细胞增殖的凋亡和自噬机制之间的相关性进行了深入的研究。 目的：1.研究白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡的机制； 2.研究白藜芦醇诱导HL-60细胞自噬的机制； 3.研究凋亡和自噬现象在白藜芦醇诱导HL60细胞死亡中的相互关系。 【材料和方法】： 用含10％超级新生牛血清的 RPIM-1640培养基体外培养人早幼粒白血病HL-60细胞，用相对应的抑制剂或激活剂(Compound C,3-MA，Rapamycin，Bafilomycin A1，Z-DEVD-FMK等)或者干扰RNA（SiAtg5，SiBeclin-1，SiP62，SiLC3)预处理细胞，并用含不同浓度的白藜芦醇(0μM,25μM，50μM,100μM)的培养基处理处于对数期的HL-60细胞0-48小时后，MTT方法检测细胞的存活率；DAPI染色分析细胞凋亡；caspase-3试剂盒检测caspase-3酶活性的变化；流式细胞Annexin v-FITC PI双染法技术检测凋亡细胞所占比例；全波长荧光酶标仪测定相关的荧光值变化(线粒体膜电位)；免疫荧光观察凋亡和自噬相关基因在细胞中的亚定位和表达；Western Blot检测相关蛋白的表达量；RNA干扰技术分析信号传导通路。 【结果】： 1. MTT法检测，白藜芦醇抑制人急性早幼粒HL-60细胞增殖，且这种作用呈剂量和时间依赖性关系，经过计算白藜芦醇作用24 h后 IC50为58μM。 2. DAPI染色及流式细胞术Annexin v-FITC/PI双染法以及Western Blot技术检测等实验显示当24 h、0~100μM白藜芦醇及0-48 h、50μM白藜芦醇作用HL-60细胞时，有明显凋亡现象出现,且该现象与白藜芦醇的剂量和作用时间呈依赖性关系。caspase-3酶活性的检测结果是随着白藜芦醇作用时间延长和浓度的增加显示caspase-3酶活性增强；并且加入caspase-3抑制剂后，caspase-3酶活性，细胞生存率及蛋白表达量均有所下降。 3.全波长酶标仪检测罗丹明123染色后的经过白藜芦醇处理的细胞显示其线粒体膜电位逐渐下降；Western Blotting检测凋亡相关线粒体通路的相关蛋白表达显示随着白藜芦醇作用浓度增加和时间的延长，Bax/Bcl-2比值上升，Bad磷酸化水平降低。说明白藜芦醇诱导的HL-60细胞凋亡经过线粒体通路。 4. Westen Blot检测细胞凋亡死亡受体通路相关蛋白发现Fas-L，Fas逐渐增加，caspase8被激活，Bid逐渐转变为tBid。说明白藜芦醇诱导的HL-60细胞凋亡也经过死亡受体通路。 5.免疫荧光，Western Blot技术检测以及PCR技术分析等实验显示当0-100μM白藜芦醇作用HL-60细胞0-48 hours时，有明显自噬现象出现,且该现象与RSV的剂量和作用时间呈依赖性关系。Western Blotting以及PCR技术分析显示自噬相关基因Beclin-1及P62的表达量增加。 siRNA干扰相关的基因的表达后，自噬现象减弱。 6. MTT细胞存活率检测法，caspase-3酶活性检测及自噬抑制剂，激活剂，siRNAs分析等试验分析显示白藜芦醇诱导的自噬引起细胞死亡，即自噬性细胞死亡。 7. Western Blot检测自噬相关通路的蛋白表达，随着白藜芦醇作用浓度增加和作用时间增长，AMPK-mTOR通路被激活，激活P-AMPK，P-Raptor,下游的P-p70s6K表达量降低，这种升高或降低能明显的被相关的抑制剂逆转，同时自噬现象被相关抑制剂减弱。说明AMPK通路参与白藜芦醇诱导的HL-60细胞自噬。 8. MTT细胞存活率检测法，caspase-3酶活性检测及自噬抑制剂，激活剂，Caspase-3抑制剂，siRNAs分析等试验分析显示白藜芦醇诱导HL-60细胞的凋亡和自噬同时存在且存在一定程度的正相关。 【结论】： 1.白藜芦醇在一定浓度、时间范围内抑制体外培养的人早幼粒白血病HL-60细胞的生长和增殖，其机制与白藜芦醇诱导HL-60细胞发生凋亡性死亡和自噬性死亡有关。 2.白藜芦醇能够诱导HL-60细胞发生凋亡跟线粒体和死亡受体通路有关；其诱导发生的凋亡依赖于自噬，且细胞在白藜芦醇作用下LKB1磷酸化被激活，进而激活AMPK-mTOR通路。