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干扰素是一类多功能细胞因子，是由哺乳动物体细胞合成与分泌的生物活性蛋白质，具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长与调节机体免疫功能的作用。其基因表达受多种因素和调控原件的调节。干扰素基因工程和基因治疗研究引起了广泛的关注，目前已被应用于临床研究。
猪γ干扰素具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药剂和免疫佐剂具有广泛的应用前景。但是，动物体内一般情况下只产生极其微量的IFN，难以抵御病毒的感染。因此，本实验在体外对去除C端不同数目氨基酸的猪γ—干扰素蛋白表达，旨在获得高表达量和高活性的猪γ—IFN，并用于预防和治疗猪的病毒性疾病。
根据NCBI已发表的猪γ—干扰素的核苷酸序列，设计并合成了四对引物P1/P2、P1/P3、P1/P4、P1/P5。根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，在上游引物P1中加入了限制性内切酶EcoRⅠ识别位点，去掉了IFN—γ基因原有的信号肽和起始密码子，并增加一个对框碱基，以正确对框猪γ—干扰素基因和其融合的载体序列：在下游引物P2、P3、P4、P5中加入了限制性内切酶KpnⅠ识别位点，并保留了原有终止密码子。为使目的蛋白的分泌表达，本实验采用了毕赤酵母表达载体的β因子信号肽。此信号肽能引导目的蛋白离开细胞，分泌于培养基中，方便蛋白质提取与纯化。
本实验首先采集猪静脉血，从中分离出猪淋巴细胞，用ConA诱导培养猪淋巴细胞，提取猪淋巴细胞的总RNA。以淋巴细胞总RNA为模版，分别以P1/P2、P1/P3、P1/P4、P1/P5为引物通过RT-PCR方法获得了4段不同的猪γ—干扰素基因成熟蛋白对应的基因序列，扩增长度分别为432bp、423bp、414bp、405bp。经过克隆、鉴定后，将目的片断与表达载体pPICZαC分别经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，然后将酶切产物连接并转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPICZαC—IFN，并进行测序鉴定。结果显示目的片段已经正确插入表达载体pPICZαC。重组表达质粒pPICZαC—IFN经SacⅠ单酶切处理后，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X33，转化菌液用冰山梨醇温育培养30min，涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置28℃温箱培养4～5d，结果获得多个单菌落。挑取单个菌落，先用BMGY培养基(含甘油)激活培养约24h，OD值达2～6。收集菌液，3000rpm离心2min，弃上清。用BMMY培养基(含甲醇)重悬菌体，置摇床28℃、250rpm诱导表达。每24h添加一次甲醇，保持终浓度1.0％。诱导表达4d后，收集菌液，离心，取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析，可见一条分子量稍大于20KDa清晰蛋白条带，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带。表达产物进行Western—blotting分析，显示在稍大于20KDa处出现了一条特异的显色条带，表明表达产物是猪的γ—干扰素。
取上述甲醇诱导表达后的上清液，先进行过滤除菌，然后用DMEM4倍稀释成不同浓度后，移入预先培养好的Vero96孔细胞培养板，每孔100μL。每个浓度作6个重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。培养过夜。用100μL100倍TCID50VSV攻毒，细胞对照孔不加病毒液。37℃、5％CO2条件下培养约24h至36h。待病毒对照孔出现完全细胞病变时，判断结果，并根据细胞的病变程度，按5分级制进行打分。50％细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为1个干扰素单位。
结果显示本研究成功地在重组毕赤酵母中表达出4种氨基酸数目不同的猪γ—干扰素(成熟的猪γ—干扰素、去除C端3个氨基酸的猪γ—干扰素、去除C端6个氨基酸的猪γ—干扰素、去除C端9个氨基酸的猪γ—干扰素)，该4种表达蛋白均能够干扰VSV病毒在Vero细胞上的复制，去掉C端6个氨基酸的γ—干扰素的抗病毒活性最高，效价为5.8×106IU/L。表明该蛋白在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。