鸡胚营养组合物对衰老大鼠骨髓间充质干细胞保护作用的研究

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目的:  采用D-半乳糖的方法建立衰老大鼠模型,用以评价鸡胚营养组合物对衰老大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的保护作用。  方法:  (1)采用ELISA方法检测鸡胚蛋中干细胞因子(SCF)、神经细胞生长因子(NGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、白介素(IL-2、IL-4)的含量。  (2)建立衰老模型。75只SD大鼠随机分为5组:对照组、D-半乳糖组、鸡胚营养组合物组、鸡胚组、营养组合物组。除对照组外,D-半乳糖组、鸡胚和营养组合物处理组大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖(500mg/kg/d)90天。鸡胚营养组合物组、鸡胚组、营养组合物组大鼠采用不同剂量的鸡胚和营养组合物进行灌胃。通过检测以下指标,来判断模型建立是否成功。通过Morris水迷宫实验对大鼠学习记忆能力的变化进行评估;获取大鼠脾脏和胸腺,测定脏器指数;收集大鼠血清,检测SOD、GSH-PX、CAT和MDA的含量;采用ELISA方法对大鼠血清中炎性因子IL-1β和IL-2的含量进行检测。  (3)大鼠血清被分离用于BMSCs的培养;通过流式细胞术鉴定BMSCs;采用CCK-8和克隆实验检测BMSCs的增殖能力;采用茜素红和油红O染色观察BMSCs的成骨成脂分化能力;采用全基因组表达谱测序技术分析各组大鼠BMSCs的基因表达差异;采用实时荧光定量PCR检测BMSCs端粒的长度、成脂成骨细胞相关基因以及差异基因的表达量;应用western blot实验从蛋白质水平上测定差异基因的表达量。  结果:  (1)SCF、NGF、EGF、IL-2和IL-4在孵化第三天的鸡胚中含量最高。  (2)与对照组相比,D-半乳糖单独处理可引起大鼠学习记忆能力减退,脾脏以及胸腺指数下降,SOD、GSH-PX、CAT活力和IL-2含量显著降低,而MDA和IL-1β含量明显升高。与衰老组相比,鸡胚营养组合物组大鼠学习记忆能力显著改善,脾脏和胸腺指数显著提高,SOD、GSH-PX、CAT活力和IL-2含量明显升高,而MDA和IL-1β含量明显降低。  (3)鸡胚营养组合物能够促进衰老大鼠BMSCs的增殖和成骨分化,抑制其端粒缩短及成脂分化。全基因组表达谱测序技术分析显示,在D-半乳糖组中59个基因高表达和326个基因低表达,而在鸡胚营养组合物组中59个基因低表达和326个基因高表达。实时定量PCR和免疫印迹实验从mRNA和蛋白水平进一步验证,结果显示,鸡胚营养组合物能够调节BMSCs中基因异常的表达。  结论:  (1)选取孵化第三天的鸡胚进行下一步抗衰老实验。  (2)成功建立衰老大鼠模型。  (3)鸡胚营养组合物能够拮抗D-半乳糖对BMSCs致衰老的作用。
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