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目的：利用含人血管内皮生长因子(VEGF)基因的腺病毒表达载体(Ad-VEGF)转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),采用局部肌肉注射的方法将VEGF基因修饰的BM-MSCs移植到糖尿病大鼠的后肢缺血部位,探讨经VEGF基因修饰的BM-MSCs移植治疗糖尿病后肢缺血的可行性及其应用潜力。方法：(1)大鼠BM-MSCs分离、培养与免疫表型鉴定：无菌条件下剪取2-3周龄SD大鼠两侧完整股骨、胫骨,采用D-PBS冲洗骨髓腔,含骨髓细胞的洗脱液经离心后收集细胞沉淀,用含10%FBS的LG-DMEM,于37℃、5%CO2饱和湿度环境下进行BM-MSCs原代培养,每2d换液1次,同时洗脱未贴壁的血细胞；当BM-MSCs生长汇合度达60%～80%时,按2-5×105/ml细胞密度进行传代培养。采用流式细胞术对第3代BM-MSCs进行CD45.CD29和CD90免疫表型分子分析,并对其进行BrdU体外标记。(2)Ad-VEGF腺病毒载体扩增与效价分析：用含10%FBS的HG-DMEM,于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养HEK293细胞,待细胞生长汇合度达50%-80%时,采用直接转染法将Ad-VEGF加入到HEK293细胞中,48h后收集细胞,置-80℃和37℃反复冻融3次,离心收集病毒上清后按10倍梯度稀释,将病毒液加入到接种密度为1×104/孔的HEK293细胞96孔培养板中,18h后在荧光显微镜下进行荧光细胞计数,计算病毒效价。(3)Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs:第3代BM-MSCs生长汇合度达50%～80%时,弃培养基,加入不同浓度Ad-VEGF,用含2%FBS和10ng/ml bFGF的LG-DMEM培养基继续培养,48h后荧光显微镜下观察,流式细胞仪检测GFP表达效率,结合病毒对细胞生长的影响,以确定理想的感染复数(MOI)值。(4)大鼠2型糖尿病后肢缺血模型的制备：采用成年雄性SD大鼠,经高脂饲料喂养1个月后(体重达380～450g),剪尾取血检测血脂变化,按30mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备2型糖尿病模型；糖尿病大鼠经10%水合氯醛(0.33ml/100g)腹腔注射麻醉后,无菌条件下于腹股沟韧带下方手术结扎、离断双侧股动脉,并剥离其周围远端分支血管,制备2型糖尿病后肢缺血模型。(5)模型细胞移植试验：将建模成功的2型糖尿病后肢缺血大鼠随机分为Ad-VEGF转染BM-MSCs移植组(n=13),Ad-GFP转染BM-MSCs移植组(n=14)和BM-MSCs对照移植组(n=15)。取第3代BrdU标记的上述各组BM-MSCs,用400gL生理盐水制成单细胞悬液(含细胞总数2×106个),自股动脉离断处起分10个点注射入左后肢的股直肌和腓肠肌中；右后肢相同部位注射等量生理盐水作为对照。(6)移植效果评价：于移植后2w、6w、10w随机选取模型大鼠,采用腹主动脉穿刺插管,以1ml/s速度、111KPa压力注入4m130%碘海醇进行数字减影血管造影(DSA),以显示双后肢动脉及灌注情况；造影后分别取2型糖尿病模型大鼠及移植大鼠双侧股直肌和腓肠肌,常规石蜡包埋、切片(厚5μm)及HE染色,置光镜下观察,分别统计股直肌和腓肠肌的毛细血管数和肌纤维数,以两者比值计算毛细血管密度；实验还采用免疫荧光组化技术,对BrdU标记BM-MSCs移植细胞的体内存活进行冰冻切片示踪分析。结果：(1)分离纯化的大鼠BM-MSCs具有典型的间充质干细胞表型特征,高表达CD90和CD29,不表达CD45; BrdU标记细胞阳性率达到75%以上。(2)在HEK293细胞中成功扩增获得的Ad-VEGF病毒效价为8×108pfu/ml。(3)当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达53%,且不影响细胞活性；而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs细胞活性抑制明显。(4)高脂组体重达404.44±18.41g、血甘油三酯(TG)为1.46±0.29mmol/L、总胆固醇(TC)为2.39±0.39mmol/L,均较普食组显著增高(P<0.05)；高脂组STZ注射前及注射后1d、7d、14d的大鼠外周血血糖值分别为5.8±0.60mmol/L、20.52±4.01mmol/L、25.63±4.74mmol/L、24.12±3.35mmol/L,注射STZ后的血糖检测值均高于16.7mmol/L的糖尿病制模标准；上述体重、血脂、血糖增高程度符合2型糖尿病病理生理特征。模型大鼠双后肢结扎剥离股动脉及其分支后,后肢骨骼肌急性缺血并呈暗紫色。(5)DSA结果显示,模型大鼠股动脉在腹股沟韧带处中断,各组移植细胞2w、6w、10w后双后肢均可见血管显影,且血管数随时间推移渐丰富,Ad-VEGF转染BM-MSCs组大鼠左、右侧后肢血管均较BM-MSCs组、Ad-GFP转染BM-MSCs组明显丰富,但各组大鼠自身左侧血管较右侧增多不明显。(6)HE染色肌肉组织切片毛细血管密度分析显示,移植2w、6w、10w后,Ad-VEGF转染BM-MSCs组双侧股直肌和腓肠肌的毛细血管密度均较BM-MSCs组和Ad-GFP转染BM-MSCs组对应肌肉丰富(P<0.05)。移植2w时,各组左侧股直肌与腓肠肌的毛细血管密度均高于其右侧的股直肌和腓肠肌(P<0.05);移植6w时,BM-MSCs组、Ad-GFP转染BM-MSCs组左侧腓肠肌的毛细血管密度高于其右侧,而Ad-VEGF转染BM-MSCs组左侧股直肌和腓肠肌的毛细血管密度均高于右侧,且该组这一特征延续到移植后10w(P<0.05)。(7)双荧光标记结果显示,移植后2w,各组左侧股直肌肌纤维间见BrdU标记阳性移植细胞。结论：成功实现Ad-VEGF修饰大鼠BM-MSCs,经局部注射移植BrdU标记的VEGF基因修饰的BM-MSCs可以定植在病损组织中,并可改善糖尿病后肢缺血大鼠后肢血供,初步证实了VEGF基因修饰BM-MSCs移植治疗糖尿病后肢缺血的可行性。