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癌症是细胞分裂失常引发的异质性疾病,多种遗传和环境因素在有癌症发生发展过程中起作用。癌症是是对人类健康的重要威胁,是世界上致死的最主要的疾病之一。癌细胞转移和癌症患者对抗癌方案的不同反应是癌症治疗的主要障碍。在过去的几十年中,化学疗法仍然是治疗癌症的常规选择,合成的和源于植物的化学治疗剂显示出卓有成效的抗癌效果。但化学治疗剂的持续使用会导致不良反应和耐药性等问题。因此迫切需要开发无毒的抗癌药剂用于治疗,特别是转移阶段。无毒的抗癌药剂可用于单一疗法或与化学治疗剂联合治疗。腺病毒载体是人类用于基因治疗的首批病毒载体,具有高转导效率、低毒性和大规模生产成本低廉等优点,一直被认为是有吸引力的基因治疗方案。在检查腺病毒疗法的有效性时,主要采用两种不同类型的腺病毒载体,一种是条件复制型溶瘤腺病毒,另一种是复制缺陷型腺病毒载体。溶瘤病毒能够选择性感染并裂解肿瘤细胞,作为抗癌途径很有吸引力。腺病毒是递送抑癌基因或诱导溶瘤的最常用的介质。在中国使用条件复制腺病毒(CRAd)治疗头颈癌,以及美国最近宣布接受溶瘤病毒治疗,使人们对溶瘤病毒疗法的抗癌潜力感到乐观。治疗性复制缺陷型腺病毒趋向肿瘤部位递送目的基因,这些基因可以抑制肿瘤。可以通过缺失腺病毒基因组的E1A/B区来构建复制缺陷型腺病毒受体,E1A/B基因是腺病毒复制所必需的,E1A/B基因的缺失不仅使病毒载体复制不足,而且提供了插入具有治疗性质的基因(如p53和p14ARF肿瘤抑制基因)的机会。多项研究报道了腺病毒载体的有效抗肿瘤功效。p53作为抑癌基因广为人知且被充分研究。响应DNA损伤和细胞应激信号,p53被激活并触发大量下游事件导致肿瘤抑制。p53途径对肿瘤的抑制作用包括诱导凋亡、细胞周期阻滞(G1-S,G2-M)、抑制血管生成和DNA修复。p53基因的缺失或突变存在于50%以上的癌症中。通过病毒载体递送p53基因将恢复非表达p53的肿瘤中的p53蛋白水平,并提高表达p53的肿瘤中的p53蛋白水平。在这两种情况下,外源性p53最终都会抑制肿瘤的生长。P14ARF是另一个肿瘤抑制基因,通过干扰p53抑制剂MDM2泛素连接酶来稳定p53水平,帮助p53不受抑制地执行其功能。这些抑癌基因在腺病毒载体中的克隆及其向肿瘤部位的传递可阻碍肿瘤进程,实现有效抑瘤。尽管腺病毒载体有明显的抗肿瘤作用,但在临床上使用腺病毒的一个主要障碍是将其递送到肿瘤部位。在许多研究中,瘤内注射腺病毒载体抑制了肿瘤的生长,但是全身递送不能产生令人满意的结果。有效性低可能是因为需要高剂量的病毒载体(>1012个颗粒),大多数病毒颗粒无法传播到肿瘤中并被网状内皮系统清除,病毒载体激活宿主免疫系统等。开发新方法来系统递送腺病毒载体可以避免这些问题。间充质干细胞(MSCs)可作为腺病毒载体的有效载体。MSC具有肿瘤趋向性和肿瘤归巢能力等优势,且能够逃避免疫应答并扩散到肿瘤块中。MSC中的某些修饰可能使它们能够包装、繁殖和特异性递送腺病毒载体至肿瘤部位。基于MSC的载体不仅将靶向局部肿瘤,而且还将靶向转移性肿瘤。鉴于文献报道和上述优化考虑,我们开发了基于MSC的新型腺病毒载体递送系统。我们通过配备腺病毒E1A/B基因对MSC进行修饰,并构建了MSC-E1。E1A/B基因对于腺病毒复制至关重要。我们研究了小鼠肿瘤模型中MSC-E1s全身递送后MSC-E1s的肿瘤趋向性和归巢能力。小鼠模型中MSC-E1s的生物分布分析和活体显微镜检查显示具有肿瘤向性和MSC-E1s的肿瘤内扩散。本研究构建了表达p14ARF/P53(Ad-bicistronic或Adbic)和Survivin调节的条件复制腺病毒载体(CRAd)的复制缺陷型腺病毒载体,在体内和体外测试并比较了游离的和MSC负载的腺病毒载体(CRAd和Adbic)在前列腺肿瘤细胞中的抗肿瘤效力。细胞毒性和细胞凋亡测定的结果表明,在载有MSC的腺病毒载体处理的细胞中,肿瘤抑制作用更为突出。同样,在接受全身递送载有MSCE1s腺病毒载体的前列腺肿瘤小鼠模型中,其肿瘤生长抑制作用比游离型对照更为显著。此外,本研究还评估了与顺铂和伊立替康联合使用的腺病毒载体对肿瘤的抑制作用,联合治疗组的前列腺肿瘤体积比单一治疗组大大减少。对化学敏感和耐药性肺癌细胞的CRAds治疗成功抑制癌细胞的增殖。耐化学药品的癌细胞表现出柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的高表达,据报道它与病毒衣壳蛋白相互作用导致其内化。本研究分别在化学敏感和耐药细胞中利用CARsi RNA进行了CAR敲低,利用CAR c DNA进行了CAR表达。通过蛋白质印迹进行的CAR蛋白验证表达量的改变。此外,与对照相比,在接受CAR-si RNA的癌细胞中腺病毒转导和肿瘤抑制显著降低。相反,与对照组相比,接受CAR c DNA的细胞表现出更高的病毒感染率和随后的肿瘤细胞死亡。由此得出结论,顺铂导致的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)上调是对化疗敏感和耐药的癌症的选择性易损性。我们还研究了单独负载Adbic并与Aloperine(ALO)(一种草药生物碱)联合使用的MSC-E1s对非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤抑制活性,并在胰腺癌(PC)中评估了单独使用Adbic并与芹菜素(API)组合使用的MSC-E1的抗肿瘤功效。多种体外实验(MTT分析,基于流式细胞仪的细胞凋亡分析,DAPI染色,TUNNEL分析,蛋白质印迹分析)的结果显示,MSC-E1单独加载Adbic并与Aloperine和芹菜素结合协同抑制NSCLC和PC的生长。我们发现可能机制是p53途径的激活。Western印迹分析显示,与对照细胞相比,单独或与化疗药物联合负载Adbic的MSC-E1s处理的肿瘤细胞中p53蛋白水平升高。P53触发的下游事件导致抗增殖活性,如凋亡诱导,细胞周期阻滞(NSCLC中的G1-S和PC中的G2-M),促凋亡(Bax,Caspase 3和Caspase 9)的上调和下调凋亡基因(Bcl2)的表达。与之类似,体内研究结果表明,单独或与ALO和API结合使用的Adbic负载的MSC-E1抑制肿瘤小鼠模型中NSCLC肿瘤和PC肿瘤的生长,联合治疗组的肿瘤生长明显降低。综上所述,在本研究中我们构建了基于腺病毒的5型E1s修饰的基于MSCs的载体系统(MSC-E1s),用于将腺病毒全身递送至肿瘤部位。研究结果显示,MSC-E1具有很好的包装、繁殖、靶向肿瘤和归巢能力。与游离腺病毒载体相比,负载MSC-E1的腺病毒载体可显著抑制前列腺癌、NSCLC和胰腺癌细胞的增殖。我们利用皮下肿瘤模型,将负载MSC-E1的腺病毒载体通过尾静脉全身递送。与空载的腺病毒载体相比,负载MSC-E1的腺病毒载体成功地靶向了肿瘤,具有出色的肿瘤内分布,并抑制了小鼠模型中的肿瘤生长。在联合治疗方法中,腺病毒载体与化疗药物联合产生协同的肿瘤抑制作用。联合治疗介导的p53途径的激活是获得协同抑制作用的最可能原因。联合治疗延长了NSCLC小鼠模型的存活率,并且抑制了小鼠模型中前列腺和胰腺肿瘤的生长。因此,这些前期成果为深入研究腺病毒载体联合治疗策略奠定了基础,并且为设计新的癌症治疗方法提供可能性。