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第一部分：山茱萸环烯醚萜苷对体外培养的新生大鼠海马神经前体细胞增殖和分化的影响
目的：缺血性脑卒中具有极高的致残率和死亡率，是目前危害人类健康的主要疾病之一，当前仍缺乏有效的治疗手段。本室前期研究发现山茱萸环烯醚萜苷(Cornel Iridoid Glycoside，CIG)对脑缺血有保护作用，并能调节拟AD模型大鼠脑内一些神经生长/营养因子的表达，但还不清楚它是否能影响脑缺血损伤后的神经发生。因此，我们首先观察了CIG对体外培养的神经前体细胞(neuralprecursor cells，NPCs)存活、增殖和分化的影响，为之后CIG对局灶性脑缺血大鼠神经发生影响的研究奠定理论与实验基础。
方法：(1)为进行NPCs的鉴定：取新生当天的SD大鼠脑海马，机械分离成单细胞悬液，以2×106个细胞/ml分别接种到含有生长因子EGF和bFGF基础培养液中。取培养7d的第二代神经球，接种到含1％FBS培养液中诱导NPCs球分化，于12h时分别行巢蛋白(nestin)和RNA-结合蛋白(Musashil)免疫荧光染色，7d时行β-III微管蛋白(β-IIITubulin/Tuj1)、胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein, GFAP)、神经丝蛋白NF-200和半乳糖脑苷脂(Galc)免疫荧光染色。为进行BrdU标记，培养基中加入含10μM BrdU，7d后行BrdU免疫荧光染色。(2)为观察CIG对NPCs存活和增殖的影响：将机械分离的单个细胞分别接种到含有EGF(20 ng/ml)和bFGF(10ng/ml)或不同剂量的CIG(10、50、100、200和400μg/ml)的DMEM/F12基础培养液中，7、14和28 d时用显微镜测微尺测量神经球的直径。(3)为观察CIG对NPCs分化的影响：取培养7d的第二代神经球，分别接种到含1％FBS的营养液或含有不同剂量CIG培养液中，7d时行NF-200免疫荧光染色，计数各组NF-200阳性细胞的数目并测量其轴突长度。
结果：(1)诱导分化12 h，免疫细胞荧光染色显示神经球中的细胞几乎均为nestin和musashi-1阳性，诱导分化7d时，神经球可分化为β-III Tubulin。NF-200和GFAP阳性的细胞，只有极少数细胞为GalC阳性；BrdU标记显示神经球中绝大部分细胞的细胞核为BrdU阳性。结果证实我们培养的细胞是NPCs，可以用来进行进一步的药物研究。
(2)培养7d时，无生长因子的空白对照组的细胞绝大部分死亡，而CIG各组(10-400μg/ml)均有小神经球形成，以200和400μg/ml CIG组数目较多；培养至28d时，200μg/ml和400μg/ml CIG组神经球体积明显增大。统计结果显示，与无生长因子对照组相比，200和400μg/ml CIG组神经球的体积显著增加(P<0.01)。
(3)无FBS对照组仅有少数细胞从神经球迁出；10和50μg/ml CIG处理组均有很多单细胞从神经球周缘迁出，并伸出较长的突起。对NF-200阳性细胞的数目统计显示：与无FBS对照组相比，10和50μg/ml CIG分化为神经元的数目和轴突的长度明显增加( P<0.05，P<0.01)。
结论：我们成功分离、培养、鉴定了新生大鼠海马NPCs，CIG可以促进体外培养的NPCs的存活和增殖及向神经元分化。结果提示，CIG可能具有通过影响神经发生而调节CNS功能的新作用。
第二部分：山茱萸环烯醚萜苷对局灶性脑缺血大鼠神经发生的影响及其机制研究
目前认为损伤级联反应是缺血性脑卒中发病的主要机制，其最终导致的是局部神经元和胶质细胞的变性、死亡和丢失。因此，如何促使受损神经元的修复或促使脑内新神经元的产生，就成为脑卒中治疗的关键。但缺血损伤诱导的内源性神经发生是一个短暂的生命活动，而且增殖的细胞分化为神经元的数目极少。因此促进内源性神经发生并提高神经元存活率，将成为神经替代和神经再生修复问题的关键。本研究在体外实验(第一部分)的基础上，进一步观察了CIG对局灶性脑缺血后神经发生、血管新生及血管内皮生长因子(VEGF)等表达的影响。
方法：采用线栓法闭塞大脑动脉(MACO)建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，分为假手术组、模型组、CIG低剂量(20mg/kg-1)、CIG中剂量(60mg/kg-1)和CIG大剂量(180mg/kg-1)组。用mNSS评分方法对大鼠进行神经功能检测。用BrdU标记内源性增殖细胞；采用免疫组织化学法观察BrdU标记的内源性增殖细胞、nestin阳性细胞及vWF阳性血管的变化。采用免疫荧光双标染色观察BrdU标记的内源性增殖细胞分化为神经元和胶质细胞的变化、内皮细胞的增殖及VEGF受体Flk-1的定位表达。采用免疫组织化学染色和Western blot检测VEGF的表达。应用RT-PCR方法检测VEGF及其受体Flk-1和Flt-1在mRNA水平的表达。
结果；(1) MCAO造模后7、14和28 d，CIG改善了局灶性脑缺血大鼠的神经功能( P<0.05，P<0.01)。(2)与模型组相比，CIG中剂量和大剂量促进了大鼠脑室下层(SVZ)的BrdU阳性细胞数目和nestin阳性细胞密度的增加(P<0.05，P<0.01)。(3)造模后28 d，CIG中剂量和大剂量处理组纹状体梗死灶周围BrdU/NeuN阳性细胞的数目较模型组增加(P<0.05，P<0.01)，BrdU/GFAP阳性星形胶质细胞的数目却较模型组降低(P<0.05)。(4) CIG中和大剂量促进了大鼠脑缺血后纹状体梗死灶周围血管密度和血管周径的增加( P<0.05，P<0.01)。(5)造模后7d，CIG中和大剂量组大脑皮层VEGF及其受体Flk-1和Flt-1在mRNA水平的表达较模型组增加(P<0.05，P<0.01)。(6)造模后7，14和28 d，CIG中和大剂量组大脑皮层VEGF蛋白的表达与模型组相比有显著性增高(P<0.05，P<0.01)。
结论：山茱萸环烯醚萜苷( CIG)可以促进局灶性脑缺血损伤后的神经发生和血管新生，改善神经功能损伤；CIG增强VEGF及其受体的表达可能是其发挥上述作用的机制之一。