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胚胎水平的休眠作为在进化中获得的最重要的生存策略之一,可以在季节性出现的逆境到来前暂时中止胚胎发育使其停滞在特定的发育时期,等待合适的生长环境信号刺激再度破除休眠继续发育成为成熟的胚胎。这个策略广泛地存在于动、植物界中,无论是古老的甲壳纲物种如水蚤、鲎虫和卤虫,还是拥有极高多样性的昆虫纲物种象家蚕和蚜虫,到高等植物如水稻、小麦和脊椎动物如鳉鱼、有袋动物和部分哺乳动物。这样广泛的分布也暗示着这个策略在进化上十分古老而且可能拥有统一的分子基础。休眠因物种不同可以发生在不同的发育时期,通常伴随着新陈代谢水平降低,细胞周期停滞,酶活性抑制和生物大分子的修饰和降解调控。休眠的发生、维持和破除都在有待探索的复杂基因调控网络的控制之下并且和环境的、内分泌的、节律的和自身转录组及蛋白组水平的变化密切联系在一起。
卤虫的休眠卵(被几丁质外壳包裹的滞育原肠胚),作为具有代表性的甲壳纲节肢动物门的休眠物种,是休眠研究的经典动物模型之一。拥有近4000细胞的休眠原肠胚保持着极低的新陈代谢和能量消耗水平,可以在干燥和寒冷等极端环境下维持数年,在自然或人为条件刺激下仍然可以破休眠继续发育并孵化出有活力幼虫。一旦休眠被打破就不可以再回复到休眠状态,胚胎会在24小时内发育成熟并孵化成有泳动能力的幼体。作为经典的休眠研究模式动物,卤虫休眠胚胎的一些生理过程研究集中于新陈代谢的抑制,细胞周期停滞,海藻糖积累,细胞质pH变化,酶活性调控和转录、翻译调控。为更好研究休眠及继续发育的过程,我们对发育的时间点的选取作了仔细的研究,因为通常表达量和修饰的变化发生时间相对较短而且蛋白质水平相对RNA水平的变化有时间上的滞后性。
基于以上目的,我们破除卤虫卵的休眠并使其再度水化在适宜的条件下继续发育至孵化成幼虫。在这个过程中根据形态学的切片分析,选取发育中不同的时间点进行基于二维电泳和MALDI-TOF/TOF质谱鉴定的蛋白组学分析及相同时间点EST数据获取。通过整合蛋白组和转录组数据,我们鉴定出29种蛋白包括75个蛋白差异点在这个过程中有显著的表达量变化,其中的6种蛋白在随后的磷酸化和糖基化分析中被鉴定出有显著的修饰形式。因为转录水平的变化相对蛋白水平的变化要更迅速,在之后的定量荧光PCR分析中,我们集中在发育的前5小时做了每半小时的密集取样并对有显著变化的9个差异表达蛋白包括COXⅠ,COXⅢ,HSP26,HSP60,HSP70,CDC48,LEA,GS1-like protein,和CLAP在活化和继续发育的早期转录水平变化做了细致的分析。通过这个分析,我们发现转录水平的变化在破休眠胚胎水化后半小时内就被检测出,暗示胚胎的活化在水化后立即启动并且是一个十分迅速且调控复杂的过程使得胚胎细胞在半小时内就开始恢复活性。这个研究为破休眠卵活化和继续发育过程提供了最新的蛋白组数据,并成为进一步开展活化过程的信号转导,能量变化和翻译后修饰相关研究的基础。