论文部分内容阅读
枯草芽胞杆菌具有强大的蛋白质分泌能力，是重要的工业用酶生产菌种。然而，该菌分泌异源蛋白的效率往往低下，尤其是那些革兰氏阴性细菌和真核生物来源的蛋白。为了拓展枯草芽胞杆菌在异源蛋白分泌生产中的应用，本论文从选择合适的信号肽，置入SecB-SecA介导的靶向途径以及提高mRNA的稳定性三个方面入手以期提高异源蛋白的分泌表达效率。 包涵体的形成是青霉素G酰化酶在枯草芽胞杆菌中分泌效率低下的原因。信号肽置换实验表明芽胞杆菌来源典型的Sec信号肽通过促进有效分泌从而避免了蛋白前体在细胞内形成包涵体，相应地培养物上清中酶活力与对照相比增加了3倍以上。这些结果表明合适的信号肽通过促进有效分泌能够避免PGA包涵体的形成。或许，合适的信号肽对于实现其他易聚集蛋白的有效分泌也至关重要。 缺失Sec系统特异的靶向分子伴侣SecB可能是一些异源蛋白在枯草芽胞杆菌中分泌效率低下的原因。通过共表达大肠杆菌SecB和与之能够进行相互作用的枯草芽胞杆菌-大肠杆菌嵌合SecA，可在枯草芽胞杆菌中置入SecB-SecA介导的翻译后蛋白质靶向途径。以分泌效率低下的麦芽糖结合蛋白突变体和碱性磷酸酶为报告蛋白，证明了这两种蛋白质的分泌量在人工置入靶向途径后分别提高了100％和60％以上。并且，这种增强在野生型SecB被那些由于携带点突变而丧失了与SecA相互作用能力的突变体代替后则观察不到，说明置入的靶向途径严格依赖SecB-SecA之间有效的相互作用。从应用的角度来看，该工作发展了一种新的策略用于增强异源蛋白在革兰氏阳性细菌中的分泌表达。 强诱导型启动子和稳定的mRNA是实现异源蛋白在枯草芽胞杆菌中高效分泌表达的有力保证。根据已经发表的mRNA稳定性与5’-UTR二级结构之间的关系，人工设计的包含IacO的5’-UTR序列不仅可以使组成型启动子的转录活性受IPTG诱导，也能够增强phoA转录本的稳定性，相应地增加PhoA的分泌量。该工作突出了5’-UTR二级结构的重要性。 总的来说，本论文通过选择合适的信号肽和置入宿主缺失的SecB-SecA靶向途径增加了异源蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌量。此外，本论文也对提高mRNA稳定性用于增加异源蛋白的分泌量进行了初步的研究。