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当前,粗纤维资源浪费严重,污染问题突出。我国畜牧生产中粗饲料利用率一直处于较低水平,而提高粗饲料利用率的有效途径之一就是寻找可有效分解植物纤维素的纤维素分解菌,并以此得到足量的纤维素分解酶,用于畜牧业生产中。因此,本研究在来自陕西杨凌的取暖用地热水样中拟筛选一种耐热性好、可分解纤维素的菌株,并通过基因工程技术改造其纤维素酶的调控基因,同时,通过优化其培养条件旨在使纤维素酶的产量大幅度提高。本研究的主要结果为:1.采用刚果红染色法从供试水样中筛选到1株能够分解纤维素的菌株。通过对其反复筛选得到了相应的单菌落,菌落周围有明显的水解圈。采用DNS法测定其菌液,发现有明显的纤维素酶活力。经革兰氏染色观察证明该细菌为芽孢杆菌属革兰氏阳性菌。经PCR扩增其基因组DNA中的16SrDNAb保守序列片段,测序并进行序列分析发现该细菌的16SrDNA保守序列与部分枯草杆菌的保守序列的同源性达到100%。结合形态学的观察,将该细菌命名为B. subtilis DR。2.通过6个独立的单因子筛选试验,首先确立了6种影响细菌生长和产酶的环境因素的最佳水平;进一步通过这6中因子的组合试验筛选建立了该细菌生长和产酶的最佳条件,即该菌适宜在pH6.5、温度37~41℃下生长;产酶的适宜温度为37~41℃,最适pH值为6～7,且发酵36h达到产酶高峰。应用CMC-Na为碳源,蛋白胨为氮源的培养基,能够使细菌良好生长,并表现较强的产酶能力。3.通过大量培养获得了该菌纤维素分解酶的酶蛋白。研究表明该菌产生的纤维素酶属于耐热性纤维素酶,只表现单一的内切酶活性,最佳的酶促反应温度为50℃,最佳酶促反应的酸碱环境为pH6.5的中性偏酸性环境,不耐强酸碱,具有比较强的耐高温特性,如在温度70℃下保温处理30min,该酶仍保留70%以上的酶活力。4.根据GenBank中已经报道的枯草芽胞杆菌纤维素酶基因序列,设计特异性引物,经PCR从B. subtilis DR基因组DNA中扩增得到一个约1.5Kb的基因片段,连接到T载体上进行测序,获得到该基因片段的DNA序列,进一步的在线比对分析表明该基因的部分碱基序列与已报道的纤维素酶基因的序列同源性达97%以上。该基因的全序列在GenBank中未见报道。借助Vecter VII软件分析确定该基因全长为1524bp,基因序列为一个完整的阅读框,起始密码为ATG,终止密码TAG连续编码508个氨基酸。5.通过第二对特异性引物扩增该纤维素酶基因,并在其5’端和3’端分别引入限制性酶切位点BamHI和NotI,将该基因序列克隆到表达载体pET-28a上,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,该基因在大肠杆菌中得到了表达。在37℃、诱导物浓度为1.0mmol/L、诱导5-6h时,该基因表达产物表现出的酶活力为0.9411U/mL,较原始菌种分泌的纤维素酶活提高了3倍。同时,收集菌体破碎得到大肠杆菌中的纤维素酶酶蛋白,经SDS-PAGE检测,确定该酶蛋白的大小为56kD。