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序列相关扩增多态性(SRAP)是近年来发展起来的一种新型分子标记系统,它无需任何序列信息即可扩增基因组,具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点,最大的特点是它针对的是基因的阅读框区域(ORFs)。SRAP以其众多的优点被广泛应用于植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学等方面。
异尖线虫广泛存在于海洋动物,目前全球的人体感染病例已达3万多例并且呈上升趋势。异尖线虫病已成为重要的食源性人兽共患寄生虫病,给人和动物带来不同程度的疾病损害,严重威胁人类的健康,是我国禁止入境的二类寄生虫病之一.而片形吸虫病是一类广泛存在于牛羊等反刍动物体内的寄生性蠕虫病,本病呈世界范围分布,所引起的疾病在全球每年造成约20亿美元的经济损失。
本研究第一部分以从波兰不同地区的鲜鱼、鳕鱼、鲽鱼、条鳕、欧鲽以及瑞典西海岸的鲱鱼体内所采集的65条简单异尖线虫(Anisakis simplex s.s.)幼虫、16条接合对盲囊线虫(Contracaecum osculatum c)幼虫及15条内弯宫脂线虫(Hysterothylacium aduncum)幼虫作为研究对象,并用国内异尖线虫幼虫样品作为比较.
第二部分以来自我国广西、四川、贵州、甘肃、黑龙江.江苏等省的不同宿主的80株片形吸虫作为研究对象,并以法国肝片吸虫作为比较,通过特异PCR鉴定所有片形吸虫的种类后,利用SRAP分子标记分别对国外异尖线虫和国内片形吸虫进行DNA多态性分析。采用10对引物组合对部分国内异尖线虫样品和国内片形吸虫样品进行PCR扩增,PCR产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染,进行引物的筛选,从中分别筛选出多态性较好.稳定性较强的4和5个引物组合。将筛选出来的引物组合分别对两部分实验样品进行扩增,分析其DNA多态性,构建其UPGMA树状图.并对异尖线虫由SRAP扩增产生的种特异条带选择性地进行回收,之后连接转化,每个克隆均随机挑取两个进行测序分析.
结果发现,异尖线虫三个种各自的种特异序列种内相似性均高达98%以上。种间相似性较低.根据这些序列分别设计种特异引物AF2/AR2、CF2/CR2及HF2/HR2,建立国外异尖线虫种特异PCR,本研究所建立的特异PCR鉴别方法,其特异性强,重复性好,证明所切下的条带确实为种特异条带,同时将为研究国外异尖线虫的分布、分类及诊断提供重要的手段。
利用SRAP标记对国内片形吸虫的研究发现,我国除了存在肝片吸虫和大片吸虫外,还存在着介于肝片吸虫和大片吸虫之间的中间型片形吸虫,在UPGMA聚类分析中也呈现明显的三个不同的群。同一种类来自不同地区的片形吸虫也表现出少许差异,尤其是中间型片形吸虫中。SRAP扩增所产生的中间型片形吸虫的DNA条带总是介于肝片吸虫和大片吸虫的带型之间。通过对肝片吸虫和中间型片形吸虫共有条带及大片吸虫和中间型片形吸虫共有条带的回收、克隆、测序,证实中间型片形吸虫确实拥有部分与肝片吸虫或大片吸虫共同的条带。根据测序结果所设计的两对引物FhF1/FhR2及FgF2/FgR2分别对肝片吸虫、中间型片形吸虫和大片吸虫进行扩增,FhF1/FhR2能扩增肝片吸虫和中间型片形吸虫,FgF2/FgR2能扩增大片吸虫和中间型片形吸虫,片段大小分别为534bp、189bp,该方法特异性和重复性均很好。
本研究首次应用SRAP分子标记技术对国外异尖线虫和国内片形吸虫的DNA多态性进行了研究,结果证明了SRAP作为一种新型分子标记,具有操作简单迅速、成本低、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点,是一种值得推广应用的新型分子标记。