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黄粉虫富含蛋白质等多种营养成分,是一种宝贵的食用昆虫资源,已在人类食品上、保健品、医药和饲料等方面得到广泛应用。黄粉虫生存能力和适应能力强、生长发育快、养殖成本低等优点,己成为当今世界上仅次子养蚕、养蜂业发展最快的养虫业之一。已经证明从黄粉虫体内提取出一种活性蛋白,具有很好的溶血栓作用,而癌症和心血管疾病是目前世界上两大生命杀手,希望通过进一步研究该活性蛋白,提供更加完善的基础实验数据,为以后找出一种高效、安全、低价的治疗药物打下基础。
本文经匀浆浸提、盐析、阴离子交换和葡聚糖凝胶过滤等方法,从黄粉虫幼虫体内提取分离纯化出一种纤溶活性蛋白(Tenebrio Fibrinolyric Proteins,TFP),纤维平板法显示其有很好的纤溶效果,非变性电泳证明其纯度,为单一组分,变性电泳测出其相对分子量约为56.1kD,蛋白质浓度为6.061mg·mL-1。
为进一步了解该酶的酶学性质,本文通过TFP作用于3种底物(BAEE、BAPNA和酪蛋白),测定不同米氏常数Km值,其中以BAEE为底物时Km值为0.182mmol／L,显著小于BAPNA为底物的Km值(1.138 mmol／L),而以酪蛋白为底物时测不出Km值。TFP作用于BAEE时使BAEE上的酯键断裂,表现出酯酶活力；作用于BAPNA时使BAPNA上的酰胺键断裂,表现为非肽类酰胺键的酰胺酶活力；而作用于酪蛋白和纤维蛋白时裂解肽键,表现为肽键酶活力,所以得出:TFP的酯酶活力>酰胺酶活力>肽键酶活力。模拟小肠环境,偏碱性,TFP未被胰蛋白酶降解,可以做肠溶性制剂。
为了探讨TFP的酶学种类,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF作用于TFP,纤维平板法测抑制酶活性,研究结果表明PMSF浓度为5mmol／L可完全抑制TFP纤溶活性,表明PMSF能有效抑制TFP纤溶活性,其对TFP的抑制作用与其浓度呈正相关。同时根据红外光谱检测结果,表明胰蛋白酶与TFP的结构很接近,而胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,蛋白酶活性部位在种系进化上具有严格保守性,因而初步推断TFP也属于丝氨酸蛋白酶。
本文还尝试性的对TFP的抗癌作用作了初步研究,通过体外培养动物癌细胞,MTT法检测,结果显示,黄粉虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞A549细胞有较显著的抑制作用,对H22细胞抑制作用不明显,对于癌细胞有选择性。另外,比较TFP和抗癌药物顺铂对肿瘤细胞A549的作用效果,得出:TFP抗癌效果很迅速,短时间就能达到较好的抑制肿瘤生长的效果,这是其它抗癌药物不可比拟的优势。可能两者作用机理不一样,还有待继续深入研究。