论文部分内容阅读
面对日益严峻的土壤重金属污染，植物-微生物联合修复技术以其绿色便捷、成本低廉等优点已成为重金属污染土壤修复的研究热点。为丰富植物促生菌强化超富集植物修复镉（Cd）污染土壤的作用机理，本研究以本实验室前期筛选到的重金属耐性微生物——肠杆菌FM-1（Enterobactersp.FM-1）为研究对象，采用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术对肠杆菌进行了标记，分析了标记菌株的遗传稳定性、荧光检测、生长曲线以及耐Cd特性，比较了野生菌株和标记菌株在生理特性上的差异；并将野生菌株和标记菌株接种于重金属污染土壤和植物体中，研究了肠杆菌在植物根际土壤、植物体内的定殖数量和分布规律，探讨了肠杆菌促生特性对植物生物量、植物体吲哚乙酸（IAA）含量、磷素含量、抗氧化酶系统以及对Cd吸收等的影响。得出了以下结论：
（1）挑选能在含50μg/ml卡那霉素平板上生长的GFP标记的肠杆菌菌落，经PCR扩增后在凝胶电泳成像系统的726bp（目的基因）处能观察到清晰阳性条带，表明GFP基因已转入肠杆菌FM-1，且从荧光显微镜中能观测到该菌发出绿色荧光，说明GFP基因在肠杆菌FM-1细胞内已成功表达；另外，标记菌株在连续传代50次后，仍然能在抗性平板上生长，且质粒稳定性达到95%以上，表明其遗传稳定性良好；不仅如此，标记菌株与原生菌株在生长以及对Cd2+的耐受性等方面无显著性差异。表明肠杆菌FM-1-GFP是一株对重金属具有良好耐性且荧光特性良好的菌株。
（2）通过盆栽实验，将荧光标记的肠杆菌接种于矿区恢复区和下游区两种土壤中，菌株在土壤中均可稳定定殖约14天，但两种土壤中的菌落数随处理时间的延长而呈下降趋势；通过荧光显微镜观察，在超富集植物鬼针草（Bidens pilosaL.）、积雪草（Centella asiaticaL.）、龙葵（Solanum nigrumL.）根部的断裂处、主侧根连接处、维管束组织、根尖分生区以及内外根表皮等多种植物组织中能成功检测到绿色荧光，表明该菌可在三种超富集植物的根际定殖，定殖量约为105-106CFU/g。
（3）接种中高浓度肠杆菌显著提高了植物的生物量，根茎叶中IAA、铁、磷含量以及植物对Cd的吸收。鬼针草、积雪草、龙葵的株高和株重分别比对照增加了50.73-85.19%与161.49-269.58%、64.75-134.91%与190.44-327.30%、72.67-158.04%与197.94-487.68%；且根茎叶中IAA、铁以及磷素的含量在添加肠杆菌处理下相比对照明显升高，其中IAA增加了24.17-337.59%，铁和磷素含量分别增加了145.47-195.65%、32.72-100.30%；此外，植物的根茎叶对重金属的富集也随着接种浓度的增大而提高，其中在矿区的下游区土壤上，栽培的鬼针草叶片在1.1×109CFU/ml浓度处理下富集量达111.67mg/kg，比CK提高了69.71%，积雪草茎叶Cd含量在加菌处理下均大于100mg/kg，龙葵的根茎叶Cd含量同样在高浓度肠杆菌接种下达最大值，分别为对照的1.54、1.87和2.82倍。
（4）肠杆菌对蔬菜缓解重金属胁迫下氧化应激等方面具有巨大的潜在作用：该菌不仅能分泌IAA及溶磷等物质促进植物生长，还可通过激活植物色素合成酶提高叶绿素和类胡萝卜素含量，进而增强光合作用以促进蔬菜生长。其中，叶绿素含量在中高接种浓度下增加了48.03-155.09%，类胡萝卜素提高了48.31-124.35%；此外，肠杆菌还参与调解植物的抗氧化机制，促进了过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的合成，加速了超氧化物歧化酶（SOD）消除超氧根离子（·O2-）等活性氧（ROS）过程，激活了蔬菜的抗氧化酶系统；同时，接种肠杆菌有助于大量的谷胱甘肽（GSH）转化为植物螯合肽（PCs），加快了巯基（-SH）对重金属的螯合与清除，缓解了Cd胁迫所引起的重金属毒害作用。
（1）挑选能在含50μg/ml卡那霉素平板上生长的GFP标记的肠杆菌菌落，经PCR扩增后在凝胶电泳成像系统的726bp（目的基因）处能观察到清晰阳性条带，表明GFP基因已转入肠杆菌FM-1，且从荧光显微镜中能观测到该菌发出绿色荧光，说明GFP基因在肠杆菌FM-1细胞内已成功表达；另外，标记菌株在连续传代50次后，仍然能在抗性平板上生长，且质粒稳定性达到95%以上，表明其遗传稳定性良好；不仅如此，标记菌株与原生菌株在生长以及对Cd2+的耐受性等方面无显著性差异。表明肠杆菌FM-1-GFP是一株对重金属具有良好耐性且荧光特性良好的菌株。
（2）通过盆栽实验，将荧光标记的肠杆菌接种于矿区恢复区和下游区两种土壤中，菌株在土壤中均可稳定定殖约14天，但两种土壤中的菌落数随处理时间的延长而呈下降趋势；通过荧光显微镜观察，在超富集植物鬼针草（Bidens pilosaL.）、积雪草（Centella asiaticaL.）、龙葵（Solanum nigrumL.）根部的断裂处、主侧根连接处、维管束组织、根尖分生区以及内外根表皮等多种植物组织中能成功检测到绿色荧光，表明该菌可在三种超富集植物的根际定殖，定殖量约为105-106CFU/g。
（3）接种中高浓度肠杆菌显著提高了植物的生物量，根茎叶中IAA、铁、磷含量以及植物对Cd的吸收。鬼针草、积雪草、龙葵的株高和株重分别比对照增加了50.73-85.19%与161.49-269.58%、64.75-134.91%与190.44-327.30%、72.67-158.04%与197.94-487.68%；且根茎叶中IAA、铁以及磷素的含量在添加肠杆菌处理下相比对照明显升高，其中IAA增加了24.17-337.59%，铁和磷素含量分别增加了145.47-195.65%、32.72-100.30%；此外，植物的根茎叶对重金属的富集也随着接种浓度的增大而提高，其中在矿区的下游区土壤上，栽培的鬼针草叶片在1.1×109CFU/ml浓度处理下富集量达111.67mg/kg，比CK提高了69.71%，积雪草茎叶Cd含量在加菌处理下均大于100mg/kg，龙葵的根茎叶Cd含量同样在高浓度肠杆菌接种下达最大值，分别为对照的1.54、1.87和2.82倍。
（4）肠杆菌对蔬菜缓解重金属胁迫下氧化应激等方面具有巨大的潜在作用：该菌不仅能分泌IAA及溶磷等物质促进植物生长，还可通过激活植物色素合成酶提高叶绿素和类胡萝卜素含量，进而增强光合作用以促进蔬菜生长。其中，叶绿素含量在中高接种浓度下增加了48.03-155.09%，类胡萝卜素提高了48.31-124.35%；此外，肠杆菌还参与调解植物的抗氧化机制，促进了过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的合成，加速了超氧化物歧化酶（SOD）消除超氧根离子（·O2-）等活性氧（ROS）过程，激活了蔬菜的抗氧化酶系统；同时，接种肠杆菌有助于大量的谷胱甘肽（GSH）转化为植物螯合肽（PCs），加快了巯基（-SH）对重金属的螯合与清除，缓解了Cd胁迫所引起的重金属毒害作用。