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黏着斑激酶(FAK)是一种定位于黏着斑的非受体型蛋白酪氨酸激酶,在整合素以及生长因子受体介导的细胞粘附信号传导过程中起重要作用。在肿瘤发生和发展过程中,FAK是调控细胞生存、增殖、迁移和侵袭的关键分子,越来越多的证据表明在广泛种类的人类和动物肿瘤中FAK表达量或活性普遍升高,暗示FAK在肿瘤发生过程中扮演重要角色,但FAK在肿瘤中高表达的机制目前并不明确,关于FAK基因的转录与表达调控研究也很少。
因为FAK在肿瘤发展的不同阶段如肿瘤发生、转移、侵袭和细胞生存过程中的重要作用,在开发抗肿瘤药物研究方面,FAK应该被当作潜在的治疗靶点,因此需要开发FAK的选择性抑制剂。事实上,目前已经有一些研究评估FAK作为肿瘤治疗靶点的可行性,并开发了一些抑制FAK磷酸化或激酶活性的小分子抑制剂,目前存在的问题是怎样提高抑制剂的特异性,同时也有研究证明FAK激酶活性或磷酸化在肿瘤迁移过程中并不是必需的,因此抑制FAK激酶活性或其磷酸化并不一定能抑制肿瘤的迁移,抑制FAK基因的表达也应该值得尝试,或许能得到较好的效果,采用小RNA干扰的方法抑制FAK基因的表达基本证明了以上观点。本论文在研究FAK基因表达调控机制的基础上,通过筛选抑制FAK基因转录的小分子药物,并验证其抑制肿瘤转移效果,为筛选调控FAK基因表达的药物提供一定的基础和方法。
雷公藤内酯醇是分离自多年生卫矛科植物雷公藤(Tripterginum Wilfordii Hook.F)的二萜类三环氧内酯化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗生育等多种活性,我们在研究雷公藤内酯醇活性的过程中,发现它具有很强的抑制FAK基因启动子活性的能力,进一步研究发现它除了具有报道较多的抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的活性以外,还可以显著地抑制肿瘤细胞迁移及肿瘤转移的能力。
在第一章中,通过在B10F10细胞中转染小鼠FAK基因启动子报告基因载体,筛选抑制FAK基因启动子活性的小分子药物,发现雷公藤内酯醇可以剂量依赖性的抑制FAK基因启动子的转录活性,随后在细胞水平上通过使用不同剂量的雷公藤内酯醇进行干预,采用半定量RT-PCR法检测FAK基因Mrna水平受到的影响,以及通过Western-blot方法检测蛋白水平受到的影响,结果无论Mrna水平还是蛋白水平,FAK基因的表达都受到雷公藤内酯醇剂量依赖性的抑制。在荷瘤动物模型(B16F10皮下肿瘤模型)经体内给雷公藤内酯醇治疗,然后取肿瘤组织固定、切片进行免疫组化染色的结果也显示,在体内雷公藤内酯醇也可以抑制肿瘤组织FAK基因的表达。由于FAK在肿瘤转移及侵袭过程中的重要作用,我们又通过采用伤痕愈合实验、Trans-well实验以及肿瘤被动转移动物模型检验雷公藤内酯醇抑制FAK基因的表达是否对肿瘤细胞的迁移以及肿瘤在动物体内的转移具有抑制作用,结果发现雷公藤内酯醇既可以在体外抑制肿瘤细胞的迁移,同时又可以抑制体内肿瘤的转移。
在第二章中,我们首先研究了FAK基因的转录调控,通过TRNASFAC数据库分析,预测调控FAK基因转录的转录因子结合元件,然后重点选择与调控肿瘤发生、发展及转移相关的转录因子DNA结合元件,采用分子生物学方法进行突变、并构建报告基因载体,分析突变相关位点对启动子活性的影响,并通过将报告基因载体与转录因子表达质粒共同转染,研究过表达相关转录因子的情况下,对启动子活性的调节作用,结果发现转录因子USF、PEA3、NF-κb在调控FAK启动子活性方面具有较强的作用。在此基础上,我们研究了雷公藤内酯醇调控FAK基因表达的分子机理,采用电泳迁移率改变实验(EMSA)研究雷公藤内酯醇处理对上述调控FAK基因表达的转录因子与DNA结合元件的结合情况,发现雷公藤内酯醇可以抑制细胞内PEA3和NF-Kb与其DNA结合元件的结合,从而抑制了转录因子PEA3和NF-κb对FAK基因的转录激活作用。
在第三章中,我们克隆了人FAK基因的启动子区,构建了报告基因载体,通过转染人肿瘤细胞,分析了雷公藤内酯醇等小分子药物对启动子活性的影响,结果与对小鼠FAK基因启动子活性的影响类似;采用TRANSFAC数据库分析了了启动子区的转录因子结合元件,也发现了与小鼠FAK基因启动子相似的转录因子结合序列,通过与过表达相关转录因子的质粒共转染细胞,研究过表达转录因子的情况下,对启动子活性的影响,结果表明,与小鼠FAK基因分析结果基本相同,转录因子USF、PEA3、NF-κB对人FAK基因的活性也具有较重要的调控作用。
综上所述,本论文通过研究FAK基因的转录调控,发现了对FAK基因具有转录调控作用的小分子药物雷公藤内酯醇,并进一步研究了雷公藤内酯醇调控FAK基因表达的机理,为雷公藤内酯醇抗肿瘤机理提供了新的解释。也为筛选调控FAK基因表达药物提供了新的方法。