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根瘤菌与豆科植物在长期进化过程中形成了共生固氮(SNF)的关系，这一共生体系在农业的可持续发展及固氮生态系统的研究中具有重要作用，然而固氮过程的分子调控机理还不清楚。miRNA是近年来在生物体中发现的一类长度为20～24 nt非编码的小分子RNA，通过对靶mRNA的特异降解或翻译抑制从而下调基因的表达。在多种生物体中通过克隆或生物信息学预测的方法都发现了miRNA的存在。在植物中，miRNA及其功能研究也成为了近几年的研究热点，miRNA首先在模式植物拟南芥中得以鉴别和进一步的研究，随后在水稻、小麦、杨树等多种植物中都开展了研究。miRNA参与的生物过程极其广泛，其中包括生长、发育、代谢和适应机制等。
为了进一步了解miRNA是否参与了大豆固氮功能期的基因表达调控，我们以接种后28天有固氮功能的大豆成熟根瘤为材料，构建了小分子cDNA文库。通过测序，共得到了375条序列。对这些序列进行生物信息学分析和发夹结构预测，共找到了37条序列，分别属于16个miRNA家族。其中有4个家族(gma-MIR167，gma-MIR172，gma-MIR396，gma-MIR399)在物种间高度保守，另外4个家族(gma-MIR1507，gma-MIR1508，gma-MIR1509，gma-MIR1510)在物种间的保守性较差；另外，我们还克隆到了3个新的miRNA家族(gma-MIR2107，gma-MIR2108，gma-MIR2109)，这些家族己在migBase数据库登录。另外，通过与刚公布的大豆基因组比较和发夹结构分析，我们又发现了5个新的miRNA家族，暂时命名为Glycine Max151(GM151)，GM393，GM429，GM466和GM519。通过RNA gel blot和半定量RT-PCR分析表明，克隆到的miRNA在不同处理的大豆各组织间的表达存在差异。有些miRNA(如gma-MIR172c和gma-MIR2107b)在大豆功能根瘤中的表达明显上调，而另一些miRNA(如gma-MIR1509和gma-M1R1510a)在大豆功能根瘤中的表达则明显下调。值得关注的是，gma-MIR399在低氮培养的大豆植株中几乎不表达，而在正常氮供应培养的大豆植株中的表达明显上调。对大豆功能根瘤中克隆到的miRNA靶基因的生物信息学预测结果表明，这些靶基因的功能涉及多种生物学过程。结果说明大豆功能根瘤中克隆到的miRNA在共生固氮、植物营养获取和其它发育过程中起着多种重要调控作用。我们还分别用5RACE的方法进行了gma-MIR172c和gma-MIR1510a对其预测靶基因PHAP2B和KR1切割位点的求证，结果表明切割位点主要位于与gma-MIR172c和gma-MIRl510a5端第10～11位碱基互补的靶基因位置，进一步证明了植物中miRNA对靶基因进行特异切割的负向调控机制。
根据miRNA在物种间的保守性，我们用miRBase中登录的所有植物miRNA序列，结合网上miRNA同源比对人工搜索和miRNAassist软件当地比对分析，在大豆上共找到了141条miRNA序列，进一步扩大了大豆中miRNA的数目。对这些miRNA的靶基因预测的结果表明，靶基因的功能可分为以下四类：(1)转录因子(Transcription factor)；(2)植物代谢和生长发育相关的蛋白；(3)环境胁迫响应有关的蛋白；(4)功能未知的蛋白。对生物信息学预测的miRNA，RT-PCR分析的结果表明，这些预测的miRNA在大豆根、茎和叶各组织呈差异表达，从实验上支持了生物信息学预测结果的正确性并说明miRNA可能参与了大豆的器官分化。
以经过干旱(PEG8000)、低温(2℃)和盐(NaCl)胁迫处理的大豆的叶片为材料，用Real-time PCR的方法初步分析了大豆miRNA在不同胁迫处理下的表达变化。结果表明，大部分miRNA在胁迫处理下有不同程度的上调或下调，其中gma-MIR160a、gma-MIR162a、gma-MIR169b遇盐胁迫下调明显；gma-MIR319a、gma-MIR160a、gma-MIR162a、gma-MIR169b遇低温胁迫明显下调，而gma-MIR167b则明显上调；gma-MIR168a、gma-MIR482b、gma-MIR159a、gma-MIR169d在干旱胁迫处理后极显著地受到诱导。有趣的是，同一个家族的不同成员在胁迫下会呈现出不同的表达模式。比如，gma-MIR169d在干旱胁迫处理后极显著的受到诱导，而gma-MIR169b则受到抑制。这些miRNA的表达结果为进一步剖析大豆中miRNA参与胁迫表达调控机制提供了重要线索。
通过本研究，我们从固氮功能期的大豆根瘤中克隆到了miRNA，组织特异性表达分析实验表明这些克隆到的miRNA在大豆各组织中呈差异性表达，有些miRNA在根瘤中的表达显著上调或下调，这些结果为剖析SNF的分子调控机理提供了重要线索。