论文部分内容阅读
耐高温a-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于发酵、制糖等工业，具有很大的经济价值。从高温菌中克隆高温a-淀粉酶基因，并将之转入外源宿主中实现高效表达，是耐高温a-淀粉酶开发与应用的一条新途径。
从高温泥塘淤泥中分离到一株能在高温条件下生长、而在常温下不能生长的嗜高温菌株POT5，该菌具有较强的产a-淀粉酶能力，其适宜的生长温度范围为55-75℃。利用通用引物扩增得到POT菌株的16S rDNA(1517bp)，经过核苷酸序列分析表明该菌属于地热芽孢杆菌属中的一个种，编号为Geobacillus sp．POT5。
根据该属中G．kaustophilus HTA426全基因序列测定数据中推定的a-淀粉酶基因设计PCR扩增引物，从G sp．POT5基因组中扩增得到a-淀粉酶基因(amyP)。序列分析表明该基因全长1.545 kb、G+C含量51.33％，编码514个氨基酸，编码产物的理论分子量为60.43 kD。
将amyP基因克隆至原核表达载体pET-22b(+)，将其置于lac启动子控制之下。用IPTG诱导使amyP基因在大肠杆菌菌株BL21中得到了表达。因pET-22b(+)是-融合表达载体，在外源蛋白的N-末端有一约3.3 kD融合片段，从SDS-PAGE可以看出有约63 kD的融合表达条带。淀粉酶活性染色和酶活测定也证实了amyP淀粉酶的表达。
尝试用家蚕真核杆状病毒表达系统表达amyP淀粉酶，将amyP基因插入杆状病毒转移载体pVL1393上，使其置于polyhedrin启动子之下，获得重组转移载体pVL-amyP，经与线性化的亲本病毒DNA共转染家蚕细胞后，通过体内同源重组的方式经蓝白斑筛选、纯化后获得重组杆状病毒。感染家蚕幼虫后，取发病家蚕血淋巴液进行SDS-PAGE分析、活性染色及淀粉酶活力分析，可知amyP淀粉酶的表达量远高于大肠杆菌中的表达量。