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启动子是RNA聚合酶能够识别、结合并开始转录的一段DNA序列,在基因表达调控中起关键性作用。一个经典的真核生物启动子从其结构上来看,可以大致分成两个区域,即上游调控区域(upstream cis-elements)和最小启动子区域(minimal promoter)。上游调控区域通过与反式作用因子直接或者间接地识别或结合,影响着某个或某类基因在时间或空间上的表达差异,并且这种作用是没有极性的。最小启动子是指仅仅包含TATA-box的启动子区域,该区域单独存在时没有起始转录的功能,并且只能与上游调控区域协同作用决定着基因转录方向。
本研究首次以单极性维管束特异性启动子为原型利用PCR杂交法成功构建了三种双向启动子(35sm-GRP1.8,35sm-4CL1和GRP1.8m-GRP1.8),通过农杆菌介导叶盘法进行烟草的遗传转化实验,Southern杂交结果表明本实验构建的双向启动子已经成功的整合到了烟草的总DNA中。组织化学染色法检测和荧光显微镜检测的结果表明,双向启动子能够有效的驱动gus基因和gfp基因在烟草维管组织定位表达。
荧光定量PCR的结果表明双向启动子在两个极性上的转录水平有着明显的差异性,表现为mini启动子端的表达量低于正向的GRP启动子和4CL1启动子驱动的报告基因表达量。同时在转pB35sGRP和转pB35s4CL的烟草植株中,双向启动子两端的转录水平上表现一定的共性趋势,即gfp的转录水平高的植株中gus的转录水平也高,gfp的转录水平低的植株中gus的转录水平也低。转pB35sGRP和pBGmsGRP烟草虽然都是以GRP启动子为基础构建,但是在相同的GRP端的gfp表达量上却差异性很大。
本研究主要着手于对组织特异性启动子的改造工作,将能够在维管组织特异性表达的GRP启动子,和4CL1启动子通过一定的技术手段,改变为能够进行维管组织特异性双向表达启动子,为启动子的研究及植物基因工程提供技术支持和理论依据。