番茄SlCAT2基因的克隆及功能研究

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氨基酸转运蛋白在植物体内介导了氨基酸的转运,对植物的生长发育起着极其重要的作用。根据基因序列的同源性,将植物氨基酸转运蛋白划分为两大家族:ATFs(the amino acid transporter family)和APCs(the amino acid polyamine cholinetransporter),其中CATs(cationic amino acid transporters)亚家族分属于APCs家族,植物体内对APC家族成员的研究相对较少,其中主要研究也仅集中于CATs亚家族。本研究从番茄基因组中分离了SlCAT2a与SlCAT2b两个基因,分析了它们的基因序列特征以及蛋白结构特征,构建了CAT家族蛋白进化树,对SlCAT2a蛋白进行了亚细胞定位分析,分析了它们在番茄中的时空特异表达模式,构建了SlCAT2a与SlCAT2b基因超表达载体和反义抑制表达载体,转化番茄,并分析了SlCAT2a与SlCAT2b蛋白的底物特异性,初步研究SlCAT2a与SlCAT2b在番茄生长发育过程中的生物学功能。主要研究结果如下:1、通过基因序列同源比对,在番茄基因组数据库中找到两条可能为番茄SlCAT2蛋白的EST序列,分别命名为SlCAT2a、SlCAT2b,比对后发现从SlCAT2a第474个核苷酸和SlCAT2b第159个核苷酸开始,二者的核苷酸序列完全一样,仅5’端核苷酸序列存在差异,且SlCAT2a与SlCAT2b均位于10号染色体上,在基因组上的前10个外显子的位置完全一致。2、采用RT-PCR技术克隆SlCAT2a、SlCAT2b两个基因全长片段,SlCAT2a基因全长1950bp,编码650个氨基酸;SlCAT2b全长1635bp,编码545个氨基酸。通过生物信息学分析,预测SlCAT2a蛋白有14个跨膜结构域,而SlCAT2b蛋白含有12个跨膜结构域。在CAT蛋白系统进化树中,SlCAT2a、SlCAT2b与拟南芥AtCAT2、杨树PtCAT2蛋白同属于第3亚类,通过SlCAT2a与GFP蛋白融合亚细胞定位进一步发现SlCAT2a蛋白位于液泡膜上。3、采用定量PCR方法,对SlCAT2a、SlCAT2b基因进行时空特异表达模式分析,结果表明SlCAT2a在生殖器官花中的表达量明显高于其他组织,而SlCAT2b虽在各个组织均有表达,但表达量没有明显差异。进一步检测SlCAT2a、SlCAT2b在花中不同部分的表达特征,结果发现SlCAT2a在雄蕊中表达量最高,在雄蕊、萼片、花瓣部分均微弱表达,SlCAT2b虽在花的不同部分均有表达,但表达量同样没有明显差异。4、为了研究SlCAT2a、SlCAT2b基因的生物学功能,分别构建了SlCAT2a、SlCAT2b基因超表达载体和AsCAT2反义抑制表达载体,对番茄进行遗传转化,通过GUS染色、PCR检测、抗性筛选等多种方法对转基因植株进行鉴定,并对转基因番茄中SlCAT2a、SlCAT2b的表达量进行了检测。5、对转基因植株表型进行观察统计,发现AsCAT2反义抑制植株花序形态异常,且花数目增多,有花柄在离区生出,初步推测SlCAT2可能参与到植物花器官发育的过程。6、构建酵母表达载体pDR196-SlCAT2a、pDR196-SlCAT2b,采用酵母异源表达系统探索SlCAT2a与SlCAT2b蛋白的底物特异性,结果因实验组和对照组酵母菌在多种营养培养基上同步生长,暂不明确SlCAT2a与SlCAT2b蛋白的底物特异性,以及它们是否有差异。
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