论文部分内容阅读
肠道对二肽和三肽的吸收一般都是通过小肽转运载体PepT1进行转运。PepT1是一个完整的膜蛋白,目前有关它的研究已经进入到营养和生物医学应用领域。近几年来,研究饥饿与日粮蛋白对小肽转运载体PepT1表达和活动的影响变得十分积极。本研究选择岩原鲤作为实验动物,通过常规PCR克隆PepT1 cDNA片段,并使用实时荧光定量PCR技术,研究了岩原鲤PepT1基因的组织分布,以及饥饿和不同浓度外源蛋白处理岩原鲤对PepT1基因表达造成的影响,旨在获取相应条件下的表达模式信息。本论文主要由以下3部分组成:⒈岩原鲤小肽转运载体PepT1 cDNA片段克隆及序列分析。将其它脊椎动物的PepT1 cDNA全长序列进行多序列比对,选择保守区设计引物,PCR扩增目的片段,扩增产物割胶回收并进行TA克隆,测序。克隆所得岩原鲤PepT1 cDNA片段长751bp,Genbank序列登录号GU138157(未发布),将克隆所得PepT1 cDNA片段进行BLAST搜索,结果显示该片段与普通鲤鱼的序列同一性最高(97%),斑马鱼次之(87%)。推导氨基酸序列编码250个氨基酸残基,覆盖5个跨膜区。⒉岩原鲤小肽转运载体PepT1 mRNA的组织分布。选择18S rRNA、EF1α和RFL13α作为内参基因,运用实时荧光定量PCR技术(SYBR GreenⅠ荧光染料法)对岩原鲤11个组织(前肠,中肠,后肠,脾脏,眼,脑,肌肉,心,肾脏,鳃和肝脏)的PepT1 mRNA表达水平进行相对定量。实验结果显示前肠和中肠PepT1 mRNA的表达水平显著高于其余组织(P﹤0.05),其余组织PepT1 mRNA均为低水平表达,无显著差异,而前肠PepT1 mRNA表达水平又显著高于中肠(P﹤0.05)。⒊饥饿与外源蛋白对岩原鲤幼鱼前肠PepT1 mRNA表达的影响。这部分实验研究了饥饿和灌喂不同浓度大豆低聚肽(SOP)溶液对岩原鲤幼鱼前肠小肽转运载体PepT1 mRNA表达的影响。①分别取禁食1d,3d,5d,7d,9d,11d,14d的岩原鲤幼鱼进行前肠PepT1 mRNA表达水平检测,其中禁食1d设为对照组。结果发现在所有时间点中,禁食5d,岩原鲤前肠PepT1 mRNA表达水平达到最高。②将100尾岩原鲤幼鱼随机分成4组(对照组,5%,20%,35%SOP溶液组),按2ml/100g体重的剂量进行灌喂,对照组灌喂蒸馏水代替SOP。灌喂后0.5h,1.5h,3.5h,7.5h,12h取样,每组随机取出5尾岩原鲤幼鱼用于检测SOP对其前肠PepT1 mRNA表达水平的影响。结果显示灌喂后1.5h各组岩原鲤PepT1 mRNA表达水平均无显著差异;3.5h,5%SOP组引起PepT1 mRNA表达水平增加,与该时间点其余组差异显著(P﹤0.05);7.5h,5%与20%SOP引起PepT1 mRNA表达水平增加,与对照组差异显著(P﹤0.05);12h,20%与35%SOP引起PepT1 mRNA表达水平增加,与对照组差异显著(P﹤0.05)。这表明灌喂大豆低聚肽溶液后,能诱导小肽转运载体PepT1 mRNA在前肠表达。