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背景:阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种不可逆的神经退行性疾病,常常表现为记忆力减退和认知功能障碍。近年来,已经发现了大量具有蛋白编码功能的信使RNA拥有与其反向互补的转录本,这些转录本往往具有非编码RNA的特性。许多长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)能够通过调控其靶mRNA的转录在神经系统发育和衰老以及神经退行性疾病中发挥重要作用。转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTR)的含量随年龄的增长而减少。5月龄TTR敲除小鼠在水迷宫实验中找到平台的潜伏期延长,7月龄TTR敲除小鼠出现明显的学习记忆障碍,但TTR引起学习记忆能力减退的机制尚不明确。为探究是否存在一种或一些能够对TTR进行特异性调控的长链非编码RNA,我们开展了本课题的研究。通过查阅数据库等大量资料,我们确定了一个与TTR具有反向互补特性的LncRNA AK090335,并进一步探究了LncRNA AK090335对TTR的调控模式,以及这种调控模式在阿尔茨海默症中的关键作用。目的:探究LncRNA AK090335对TTR的调控模式;探究LncRNA AK090335对TTR的调控是否能够改善AD模型小鼠的空间探索能力。方法:本实验所采用AD模型鼠均为APP/PS1小鼠。首先利用实时定量荧光PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western Blotting)技术检测6月龄,9月龄和12月龄AD小鼠模型海马组织中TTR的RNA和蛋白的含量变化,并通过查阅UCSC数据库找到与TTR反向互补的转录本AK090335,检测AK090335在各年龄段AD小鼠海马组织中的含量变化。为进一步确定LncRNA AK090335的特性,我们查阅NCBI数据库中AK090335的参考序列,设计出特异性引物进行RACE(rapid-amplification of cDNA ends)实验。将巢式PCR产物纯化回收并测序,与参考序列相比对,拼接出LncRNA AK090335的全长序列。利用分子克隆技术,将LncRNA AK090335构建到质粒载体pcDNA4.0上。接下来在神经母细胞瘤(N2a)细胞中转染pcDNA4.0-AK090335来模拟过表达AK090335的情况,提取细胞RNA和蛋白检测TTR的表达变化。采用小鼠海马DG区立体定位注射技术,将对照组AAV病毒和AAV-AK090335病毒分别注射入6月龄雄性APP/PS1小鼠模型中。一个月后通过Morris水迷宫(Morris Water Maze)和情景恐惧实验(Fear Conditioning Test)等行为学检测小鼠空间学习记忆能力,并检测海马组织中TTR的RNA和蛋白水平变化,从而判断小鼠行为学变化是否是通过AK090335对TTR的调控引起的。结果:6月龄,9月龄和12月龄AD模型鼠中TTR的表达水平随年龄的增长逐渐下降,LncRNA AK090335的表达水平也呈现相同的下降趋势,提示LncRNA AK090335很可能通过调控TTR的表达水平导致AD的发生发展。Race实验结果显示,LncRNA AK090335的5’端序列与参考序列完全匹配,但是3’端序列与参考序列不完全匹配,因此我们拼接出新的LncRNA AK090335全长序列。将过表达质粒pcDNA4.0-AK090335转染至N2a细胞,在N2a细胞中增加AK090335的表达。RT-qRCR和Western Blotting结果显示TTR的RNA水平和蛋白水平均随AK090335的表达增加而增多,提示AK090335确实能够在神经元细胞中正向调控TTR的表达。在6月龄APP/PS1小鼠海马DG区注射AAV-AK090335病毒外源性增加LncRNA AK090335的表达,通过水迷宫和情景恐惧实验观察小鼠学习记忆能力变化。水迷宫实验结果显示,在训练阶段,实验组小鼠找到平台的潜伏期明显缩短;在空间探索阶段,实验组小鼠在目的象限停留时间和穿越平台次数明显增多,提示其空间学习记忆能力明显得到改善。情景恐惧实验中,在相同场景中实验组小鼠的僵直(Freezing)百分比明显增多,说明小鼠的恐惧记忆学习能力增强。RT-qPCR和Western Blotting结果显示实验组小鼠海马组织中TTR的RNA和蛋白均升高,提示AK090335能够通过增加内源性TTR的表达改善AD小鼠受损的空间学习记忆能力。结论:TTR和其反义型LncRNA AK090335在AD小鼠海马组织中表达随年龄的增长而下调。海马中TTR和AK090335的表达下调,使APP/PS1小鼠产生了类似阿尔茨海默症的学习记忆损伤。查阅数据库和实验结果显示,AK090335的参考序列与其在海马组织中的序列存在差异。在AD鼠中上调海马中AK090335的表达,能够改善与海马功能相关的空间学习记忆损伤,并且这种改善是通过增加内源性TTR的含量实现的。因此我们可以得出结论,AK090335通过上调TTR的水平,在改善AD的学习记忆损伤中起到重要作用。